环孢素A诱导的大鼠慢性肾毒性变化及与血药浓度的关系

刘奕明1，林爱华2，邓时贵1，杨海峰3

　　环孢素A(CsA)作为一种xx免疫抑制剂主要用于器官移植的抗排异xx，但长期应用可能导致慢性肾毒性损害，严重影响移植受者的长期存活。随着CsA使用时间的延长和应用范围的扩展，对其肾毒性的认识也逐渐增加。然而，对于CsA引起的慢性肾毒性变化与其血药浓度的关系尚未xx阐明。本文在建立大鼠CsA慢性肾毒性动物模型的基础上，观察了CsA诱导的慢性肾毒性变化，并对其与血药浓度的关系进行分析，为更进一步认识CsA的肾毒性提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　试剂与仪器　环孢素A，购自杭州中美华东制药有限公司；羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，上海益壮工贸公司产品；环孢素A血浓检测试剂盒，美国雅培公司。美国Abbott TDX分析仪(荧光偏振免疫分析仪)，Modular PPI生化分析仪，AllegraTMX-12R离心机，贝克曼-库尔特公司。

1.2　动物　SD大鼠，雄性，SPF级，体重(219±18)g，广州中医药大学实验动物中心提供。低盐饮食(钠含量0.031％)和普通饮食购自广东省医学实验动物中心。

1.3　实验方法

1.3.1　CsA慢性肾毒性模型的建立及标本采集　大鼠随机分为4组：正常对照组，低盐对照组，30mg／ks剂量组(CsA-L组)，60mg／kg剂量组(CsA-H组)，每组6只。采用低盐饮食或普通饮食喂养1周后开始实验。给对照组灌胃等量CMC-Na溶液；CsA-L和CsA-H组，分别按剂量灌胃给予CsA的CMC-Na溶液，每天1次，连续4周。每周称取体重，调整CsA用量。除正常对照组进行普通饮食外，其他各组均采用低盐饮食。

　　于给药前、给药后2周和4周，收集16h尿液，记录尿量，并检测尿蛋白；眼眶采血，离心分取血浆，用于检测血肌酐(Crea)和尿素氮(BUN)；实验结束时(药后4周)，收集全血，用于测定CsA血药浓度，并处死大鼠，取肾脏纵切后固定于10％中性甲醛溶液，用于病理检查。

1.3.2　指标检测方法　尿蛋白采用干化学法测定，血肌酐Crea采用碱性苦味酸法测定，尿素氮BUN采用尿素酶法测定；CsA血药浓度测定采用荧光偏振免疫分析(FPIA)法；肾组织经10％甲醛固定后作石蜡包埋，常规石蜡切片，作HE和PAS染色。

1.4 统计学方法　采用SPSS 11.0统计软件。多组间比较采用方差分析，两两比较用LSD法。

2　结　　果

2.1　体重变化　正常对照组和低盐对照组大鼠在观察期间体重进行性增加，CsA-L组体重增长缓慢，CsA-H组则体重未见增加且略有下降。CsA-L和CsA-H组大鼠在药后2周和4周体重显著低于对照组，且差异均有统计学意义。见表1。

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2.2　尿液学变化　两对照组大鼠各指标无变化；CsA-L组尿量无变化，尿蛋白略降低，但与对照组相比差异无统计学意义；CsA-H组尿量在药后第2周明显增多，与对照组和CsA-L组相比均差异有统计学意义，药后第4周尿量减少；尿蛋白均显著低于对照组。见表2、3。

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2.3　肾功能变化　给大鼠灌胃CsA后，CsA-L组Crea升高，但与对照组对比差异无显著性，BUN升高，在药后第4周明显高于对照组；CsA-H组Crea和BUN明显升高，在药后第4周与对照组和CsA-L组相比差异有统计学意义。见表4、5。

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2.4　肾组织病理改变　正常对照组和低盐对照组大鼠肾脏的形态学未发生明显改变。CsA-L组表现为肾小管上皮细胞浊肿，空泡变性明显，小动脉改变不明显；CsA-H组则可见明显广泛性分布的肾小管上皮细胞空泡变性，坏死和脱落，肾小球系膜细胞增生明显，肾内小动脉管壁增厚，玻璃样变明显增多，肾间质发生纤维化，表现为CsA慢性肾毒性的病变特征，见图1。

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2.5　血药浓度及与肾毒性的关系　给大鼠灌胃CsA 4周后，CsA-L和CsA-H组的血药浓度分别为(3-69±0-53)μg／mL和(8.15±2.82)μg／mL，血药浓度随给药剂量的增加呈比例增加。随血药浓度升高，尿量和尿蛋白分别略有增多和减少，但两组差异无统计学意义。对血药浓度和肾功能指标Crea、BUN进行相关性分析，发现血药浓度和Crea、BUN间呈显著正相关性，r值分别为0.871和0.847(P＜0.05)。

3　讨　　论

　　关于CsA慢性肾毒性动物模型的建立，1990年ROSEN等给大鼠每天皮下注射CsA，同时给予钠缺乏饮食，结果3到4周即复制出CsA慢性肾毒性的特征性变化(间质纤维化)，说明钠耗竭是建立模型的重要条件，机制可能在于钠耗竭xx了肾素-血管紧张素系统。国内也有学者报道了该模型的建立方法，但均采用长期皮下注射或灌胃CsA油溶液，操作上存在一定的局限性。在预实验时，我们曾采用灌胃CsA油溶液的方法，但发现4周后包括对照组在内的所有大鼠均出现肝脏异常，且与周围组织粘连严重；另外发现病变在低钠饮食大鼠较正常饮食大鼠明显严重，与文献报道一致，因此本实验采用分散均匀的CsA的CMC-Na混悬液给大鼠灌胃，同时给予低盐饮食，结果4周后成功复制了CsA的肾毒性特征，且高剂量组病变特征比低剂量组更为明显，而两个对照组大鼠的肾功能和形态学均无明显变化，说明CMC-Na和低盐饮食本身对肾功能无影响。

　　大鼠在低盐饮食下，给予CsA 2周时尿量明显增多，CsA-H组与对照组和CsA-L组相比差异有显著性，提示2周时CsA已导致肾小管功能出现损伤，使尿浓缩能力下降；在第4周时尿量却呈减少趋势，分析可能由于此时大鼠肾脏出现明显的空泡变性，肾间质发生纤维化，肾功能明显损伤，健存肾单位日渐减少导致尿量减少。血中BUN和Crea能够反映肾小球的滤过功能，BUN反应较敏感，而Crea的变化则较迟缓，但它的增高一般提示肾功能已严重受损。本实验中，CsA-L组在药后2周BUN升高，但与对照组对比差异无统计学意义，药后4同时明显高于对照组，Crea有所增加，但与对照组比较差异无统计学意义；而CsA-H组在药后2周BUN即明显高于对照组，在第4周时继续升高，并明显高于对照组和CsA-L组，Crea不断升高，在第4周时明显高于对照组，表明CsA对肾功能造成了严重损害。

　　经相关性分析，Crea、BUN和血药浓度呈显著正相关，结合本实验观察到的各指标的变化，我们发现用药剂量越大，用药时间越长，血药浓度越高，CsA诱导的肾毒性越严重。

作者单位：广东省中医院1 1中心实验室，2中药制剂学实验室，3病理科(广州 510120)

来源：《广东医学》2009年1月第30卷第1期