一、外周静脉血DNA提取       二、PCR扩增          三、扩增产物的鉴定

一、外周静脉血DNA提取

1、取样本静脉血1ml，放入装有1ml抗凝剂（0.5mol/LEDTA）EP管中。
2、6000r/min离心15min，取白细胞层于另一10ml离心管中。
3、加两倍体积双蒸水，轻轻摇匀，静止15min，以破碎残余红细胞。
4、6000r/min离心15min，弃上层红细胞，留白细胞沉淀。加入1×SET缓冲液1ml，悬浮白细胞。再加入10mg/ml蛋白酶K 40ul、10% SDS100 ul（用枪吹打，使沉淀充分悬浮）。55℃水浴消化过夜。
注：a. 此后步骤皆用剪平枪头的1ml枪头操作；
         b. 每步换管后标记以防样品混淆
         c. 酚具有腐蚀性，必须带手套操作。
5、将消化液一分为二，将其转入两个1.5 mlEp管中。加入等体积的饱和平衡酚，轻轻摇匀10min，12000r/min离心15min，吸取上层水相于另一离心管中。
6、用剪平的枪头吸出上层水相于另一离心管中，弃去下层苯酚（如上层水相混浊可重复操作一次）
7、加入等体积酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），轻轻摇匀10min,12000r/min离心15min，吸取上层水相于另一离心管中。
8、加入等体积氯仿/异戊醇（24：1），操作同上。
9、加入两倍体积预冷（-20℃）的无水乙醇，轻轻摇动离心管即有白色絮状DNA析出。记录DNA的量。
10、12000r/min离心5min使DNA沉淀于管底部，弃去乙醇。
11、待DNA干燥后，加入50ul TE/管，溶解DNA，置-20℃保存。
基因组DNA的浓度测定和质量检测
（1）测定DNA浓度：吸取2ul DNA样品，在ASP-3700紫外光/可见光微量分光光度计中测定其浓度，并根据OD₂₆₀/OD₂₈₀比值分析DNA样品的纯度。
（2）检测DNA的质量：制备1.0%琼脂糖凝胶，内含0.5ug/ml溴化乙锭，倒入模具中待其自然凝固后，在电泳槽中倒入1×TBE电泳缓冲液。在DNA样品中加入1/6的Ⅲ型上样缓冲液，混合均匀后上样，同时在旁边的加样孔内加入1.5ul DNA Ladder Marker 100bp作为对照。以5V/cm电压（50V）电泳，当指示剂移至凝胶3/4时停止电泳，取出凝胶，紫外灯下观察并照相。

二、PCR扩增靶DNA
1、启动PCR扩增仪，设置程序并确定扩增条件（此步操作也可在“扩增管内容物配制”后进行）。
2、扩增管内容物配制

        用清洁的镊子取用已xx的EP管并用记号笔编号，用移液器将PCR反应的各种物质加入EP管。（每管含量见本实验室所用的37.5μl体系标准）。
3、将扩增管置于PCR扩增仪上（不带热盖的PCR仪需加矿物有避免液体蒸发），开始扩增程序。结束反应后，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。
[注意事项]

（1）PCR反应应该在专用的PCR实验室且没有DNA污染的干净环境中进行。

（2）所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。操作过程中均应戴手套。

（3）试剂或样品准备过程中都要使用一次性xx的EP管，玻璃器皿应洗涤干净并高压xx。
（4）PCR扩增内容物的配置{zh0}在冰浴上进行，并且要充分混匀。配置过程中尽量减少酶在常温下的放置时间。
三 扩增产物的鉴定
        PCR扩增产物可以通过酶切分析、凝胶电泳（琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺电泳、毛细管电泳等 ）、Southern杂交、克隆、测序等方法分析，电泳前还可以应用紫外分光光度计定量DNA。当采用凝胶电泳时也有溴化乙锭显色、银染法、荧光显色等不同的显色方法。
       本文采用的是非变性连续缓冲系统聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳及硝酸银显色分型方法
（一） 原理
        生物大分子如蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中。它们的净电荷取决于介质的H⁺浓度或与其他大分子的相互作用。在电场中，带电颗粒向阴极或阳极迁移。迁移的方向取决于它们带电的符号，这种迁移现象即谓电泳。迁移的方式目前可以根据分子尺寸大小、分子所带的电荷或分子的生物学与化学特性分为三类。

        如果把生物大分子的胶体溶液放在一个没有干扰的电场中，使颗粒具有一定迁移速率的驱动力来自于颗粒的有效电荷Q和电位梯度E。它们与介质的摩擦阻力f 抗衡：在自由溶液中，这种抗衡服从斯托克斯定律。f=6πrvη 这里v是在介质粘度为η半径为r的颗粒的移动速度。但在凝胶中，这种抗衡并不xx符合斯托克斯定律。f 还取决于介质小的其他因子，如凝胶厚度、颗粒尺寸、甚至介质的内渗率等。简言之电泳就是带电颗粒在电场中定向移动。
        银染显色的原理是用甲醛将沉积在DNA带上的银离子（硝酸银）还原成金属银而显带。
（二）仪器设备与试剂
1、仪器设备：
垂直电泳仪、垂直电泳槽、玻璃、橡胶模框、点样梳、摇床、微量进样器、染色托盘。
2、试剂：
聚丙烯酰胺（C=30% T=5%）：丙烯酰胺28.5g、N，N’-二甲基双丙烯酰胺1.5g、ddH₂O 100ml；

7％聚丙烯酰胺：30％聚丙烯酰胺23.3ml、10ml 10×TBE溶液、66.7ml ddH₂O ；

10×TBE溶液：Tris 113g、硼酸55g、1000ml ddH₂O ；

1×TBE溶液：10×TBE溶液100ml，900ml ddH₂O；

10%乙醇；

0.1%硝酸；

0.2%AgNO₃：AgNO₃ 0.15g、dH₂O 225ml；

30%NaCO₃-甲醛：NaCO₃ 30g、甲醛0.85ml；

0.1% AgNO₃：AgNO₃ 1g、1000ml dH₂O；

上样缓冲液：0.25%二甲苯氰蓝、0.25%溴酚蓝；

TEMED；

10%过硫酸胺：过硫酸胺1g、10ml ddH₂O。
（三）操作
1、电泳槽玻璃板的处理：

        用洗涤剂清洗玻璃板，自来水反复冲净洗涤剂，双蒸水冲洗3次，烘干，将两块玻璃装入恰当的橡胶模框内，并组装好电泳槽（带长玻璃的贮液槽为正极，带短玻璃的贮液槽为阴极）。
2、制胶：

        加 35μl TEMED和300μl 2.5％过硫酸胺至7%聚丙烯酰胺溶液中混匀。以60度角，缓慢注入两玻璃板间的空隙中，直至灌满模具顶部。立即插入相应的点样梳，（小心勿使梳齿下带进气泡，并且不要将梳齿全部插入胶内，留约2mm梳齿于玻璃板上端，以免拔梳时把胶孔拔断）。由于凝胶在聚合过程中有回缩，所以应小心添加些胶液于梳子处，水平放置，室温聚合1小时。向电泳槽内灌入1×TBE电泳缓冲液。小心取出点样梳，用槽内的缓冲液反复冲洗点样孔，以去除可能存在的未聚合的聚丙烯酸胺和气泡。
3、加样：

        取2-4μl扩增产物和2μl上样缓冲液混匀，用微量进样器小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可适当增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。
4、电泳：

        电泳槽接上电极开启电源，根据扩增片段的大小及电泳槽和凝胶的大小，决定电泳的电压及电泳时间。通常室温下以l~5V/cm电泳。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。
5、 银染法显色：
方法一：

a. 将PAG板浸入10%乙醇溶液固定10min，用纯水洗一次；
b. 0.1%硝酸3min，蒸馏水洗两次。
C. 0.2% AgNO₃溶液中10min，用去离子水洗三次；
d. 用30% NaCO₃-甲醛溶液显色至满意为止，用适量10%冰乙酸终止显色。
方法二：

a. 取下凝胶，蒸馏水清洗凝胶30秒。

b. 0.1% 硝酸银染色10分钟。

c. 弃去染色液，蒸馏水洗胶两次。

d. 显色液（显色液配方：10g NaOH+0.2g Na₂CO₃+2ml甲醛溶液，定溶到500ml）显色至满意为止。
6. 分型：参照基因阶梯的电泳谱带进行分型。
[注意事项]
（1）每加完一个样品要清洗微量进样器，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。
(2) 以二甲苯氰蓝和溴酚蓝的位置大致判断泳动距离，7%聚丙烯酰胺非变性胶中溴酚蓝相当于170bp的泳动距离，二甲苯氰蓝相当于40bp的泳动距离。
（3）银染时显色液配制好在4-10 度预冷可以减轻胶板的底色，银染后胶板在水中漂洗时间控制在10s以内。