1.原代细胞与细胞系有什么区别？ 细胞培养物来源于原代外植体或分散的细胞悬液。通常在这样的培养物中细胞增殖形成汇合地单层细胞或密集地细胞悬液。根据传统定义，{dy}次收获和接种的细胞被称为原代细胞[Freshney, R.I. （1987）. Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique. （New York, Alan R. Liss, Inc.）]. 这类细胞生命周期有限，在有限的生命周期内需掌握好细胞{zd0}的生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。 细胞系是不断生长，分化的细胞群，因其经过遗传改造，致使其具有无限增长的潜能。体外生长的细胞系用于医疗或科研。实际上，连续细胞系可以用大量次培养基培养，随着代数的增加细胞的基因型和表型都有可能发生改变。 需要指出的是，在不同的科研小组中这些术语的定义会有所不同。许多研究员不用细胞系这个词表示细胞群除非细胞经过了遗传改造。
2.倍增和代数有什么区别？ 倍增是培养物中细胞总数加倍，通常是指细胞指数或对数生长期。代数是指细胞群从培养瓶中移出，传代培养过程的次数，传代培养的目的是使细胞处于低密度以刺激其进一步生长。
3.接收到的冻存细胞该如何处理？ 收到包装箱后，立即将冻存细胞从干冰移入液氮中冻存。此过程尽量快以避免升温。不要将细胞储存在-80℃，这样会对细胞造成不可挽回的伤害。
4.有多少经验才能开始正常人类细胞培养？ 推荐有经验者在无菌环境下用层流净化罩工作，如果有经验的话对其它细胞类型也是很有利的。如果你是细胞培养的初学者或打算建立细胞培养实验室，我们会为你提供帮助。请联系我们的细胞培养专家。
5.冻存的细胞该如何开始培养？ ⑴将一管细胞从液氮罐中取出，注意保护手和眼睛。 ⑵用10秒钟时间将小管的盖子拧松1/4以去除残留在螺纹处的液氮，然后将盖子盖紧。 ⑶将小管放入37℃水浴中，轻轻握住并旋转，直到管内物体xx融化。 ⑷将小管立即从水浴中拿出，擦干，转入无菌环境。 ⑸用70％的酒精冲洗小管，然后擦去多余酒精。 ⑹打开盖子，注意手指不要碰到里面的螺纹。用1ml离心管离心内容物。 ⑺平衡管内物，用多聚赖氨酸xxxx瓶（多数细胞用T-75的培养瓶）。多数细胞类型推荐接种密度为每平方厘米5000细胞。 ⑻盖好盖子，轻轻摇晃培养瓶以使细胞分布均匀。若需要气体交换可打开盖子。 ⑼将培养瓶放放培养箱中（37℃,5%CO2,95%空气） ⑽植入培养后第6-16小时更换一次培养基以去除残留的二甲基亚枫和未贴壁的细胞。
6.当我{dy}次植入正常人类细胞时需要旋转细胞去除二甲基亚枫吗？ {dy}次植入正常冻存细胞时，我们不推荐旋转去除二甲基亚枫。离心过程比残留二甲基亚枫对细胞的伤害更大，尤其是不正当的高速旋转。我们的经验是如果二甲基亚枫的浓度很低，细胞不会受毒害。如果你将1ml细胞植入已加入15ml培养基的T-75培养瓶中，二甲基亚枫的浓度将小于0.67％，没有发现负面影响。实际上，如果细胞的接种密度为每平方厘米5000-10000，二甲基亚枫的浓度很低。
7.多久更换一次培养基？ 一般2-3天更换一次培养基，这取决于细胞生长的速度。许多细胞培养实验室通常在周一，周三，周五更换培养基。 注意：{dy}次植入冻存的细胞后，在6-16小时内更换培养基，以去除残留的二甲基亚枫和死亡细胞。
8.我能扩培和再冰冻ScienCell的正常人类细胞吗？ 这取决于细胞类型。一些细胞类型像神经细胞，神经胶质细胞和一些生长缓慢的上皮细胞不推荐扩培和再冰冻。其它的细胞类型像成纤维细胞、星形细胞、肾系膜细胞、星形胶质细胞等等可以扩培和再冰冻。然而，需要注意的是再冰冻的过程可能导致细胞生长性能的改变。如果你想要再冰冻细胞，请亲自咨询我们的技术支持并使用ScienCell SF-CFM，和特定的无血清培养基，以获得{zh0}的效果。
9.我能长时间冻存ScienCell的培养基吗？ 不推荐冻存培养基，冰冻高营养的培养基将导致培养基成分不可逆降解。
10.培养瓶中应该加入多少体积的培养基？ 推荐用量：T-25培养瓶5ml,T-75培养瓶15ml,T-150培养瓶30ml。
11.使用你们的专业培养基，还需要另外的补充物吗？ ScienCell 公司的培养基是为每一类细胞特定研制的。加入相关的培养成分（生长因子，xxx和胎牛血清）到基本培养液中，你就得到了xx培养基。其它的不再需要。
12.xx培养基的保质期是多久？ 加入所有的补充物后，培养液就成了xx培养基。如果xx培养基储存在4℃条件下，并且每次使用时置于常温的时间尽量少，xx培养基的保质期为6周。
13.可以使用自己的或其它公司的培养基培养ScienCell的正常人类细胞吗？ ScienCell公司的正常人类细胞使用我们的xx培养基培养并通过测试，细胞已适应此xx培养基。使用其它的培养基，由于需要适应过程可能会导致细胞不良生长。我们推荐使用我们特定的培养基培养正常人类细胞。
14.正常人类细胞能传多少代？ ScienCell不使用代数描述细胞的生长潜能，因为每一位客户用不同的分流比。ScienCell研究室保证在培养过程中使用我们的培养基和试剂，正常人类细胞达到15倍增倍增（除了在说明书中已指明的）。
15.正常人类细胞推荐的分流比是多少？ ScienCell 公司不推荐对正常人类细胞使用分流比，因为在用胰酶处理后细胞的产量会有所变化。我们推荐在胰酶作用后对细胞计数，接种密度为5000-10000细胞每平方厘米（在细胞说明书中有推荐接种密度）。
16. 可以使正常人类细胞处于实验性饥饿吗？ 可以将ScienCell 公司的正常人类细胞处于实验性饥饿。细胞在没有添加物的基本培养基中可以维持一段时间，但细胞必须处于良好的环境中。过了这段时期，实验应终止，因为时间过长将导致细胞死亡。{zh0}在实验前测试一下细胞在饥饿条件下能存活多长时间，这取决于多种因素。
17. 可以用质粒DNA转染正常人类细胞吗？ 当然，我们已成功转染了多种细胞，比如皮肤成纤维细胞，肺成纤维细胞，皮肤微血管内皮细胞等等。 加州斯坦福大学的科学家将化学xx和维生素混合，成功诱使干细胞变成了精子和卵子。他们培育出的精子有头部和短小的尾部，被认为发育成熟，xx能够使卵子受精。而卵子培育还处于研究初期，但仍然比其他科学家取得的成果要进步得多。 精子和卵子的培育进展发表于《自然》杂志，为不孕症男女有朝一日培育出自己的精卵用于xxxx疗法带来了希望。 美国科学家在实验室中通过人体干细胞制造出人工精子和卵子，在为无数不孕不育症夫妇带来福音的同时，也为人类的亲子关系带来无穷争论。 这项研究由美国政府资助。科研团队还研发出利用避孕药推迟女性绝经期的疗法，使其有更长的时间怀孕产子。而干细胞被广泛视为人体修复的重要手段，也是专家们努力研究的目标。
美国的科研团队利用生长了几天的胚胎完成了实验，但他们希望进一步利用人体表皮细胞复制精子和卵子的培育过程。表皮细胞将首先放入一种混合物中，该混合物会使表皮细胞的生物钟回溯到胚胎干细胞状态。然后再将其培育成精子和卵子。 而使用某人自己的皮肤意味着实验室培育出的精子或卵子不会与其身体出现排斥反应。 未来的科学研究也可能会利用男性皮肤培育出“雄性卵子”，或者利用女性皮肤培育出“雌性精子”。这将帮助同性恋夫妇拥有遗传学上的亲生子女。但是，很多科学家质疑，由于女性细胞中缺少男性的Y染色体，因此从中培育出精子是不可能的。 保护未出生生命协会人士安东尼-奥兹米克说：“生育过程中使用人工精子和卵子将歪曲和破坏家庭关系。任何科学成就都不能抛弃基本的伦理原则，例如要保障生命的权利。” 根据世界卫生组织公布的数字，全世界不孕症患者人数约为8000万—1.1亿，还有很多育龄夫妇由于癌症xx而无法生育。{zx1}的实验成果会帮助他们成功生育出至少从生物学的角度是他们自己的子女。然而，这同时也引发了巨大的道德和伦理争论，因为这可能会制作出xx的人工婴儿，众多男女也会逐渐退出哺育后代的行列。反对者认为肆意改变人类生育过程是错误的，并警告说xx不育症的进展有可能引发家庭成员关系的扭曲和破坏 英国谢菲尔德大学男性生育专家阿兰-佩西说：“这将会帮助我们找到xx男性不育的方法。不一定非要在实验室制造精子，我个人认为也不太可能。但是利用xx或基因疗法可能会提高男性自然生产精子的能力。我知道还任重道远，但这才是崇高的梦想。” 基督徒医学团体教授皮特-桑德拉认为，xxxx有助于维持婚姻关系。“但是，问题在于，每年要出现20万例xx，同时许多夫妇还乐于xxxx，那我们为什么还要制造人工精卵呢？” 新的研究突破将揭开精子和卵子产生的诸多奥秘，有助于进一步研发新的xx不育症的高效xx。科学家已经对精子和卵子的发育过程进行了多年的深入研究，他们认为{zd0}的问题是要弄清楚造成不育症的最主要原因，因为很多症状都出现在子宫中发育过程中。 斯坦福胚胎干细胞研究中心研究员丽塔-雷霍-佩拉认为，新的xx不育症xx将在五年后研发成功。但是，安全性和伦理争议意味着人造精子和卵子还远不能实际运用。雷霍-佩拉表示未来需要明确指导性原则，规范人造精子和卵子的使用。“无论是宗教界线，还是道德观念，或者是人权意识，都是必须考虑的重要问题。在这个领域，任何情况都要谨慎对待。” 自从人类学会蓄养动物、耕作植物以来，我们的祖先就从未停止过对物种的遗传改良。过去的几千年里改良物种的主要方式：针对自然环境造成的突变或无意的人为因素所产生的优良基因和重组个体进行选育和利用，从而通过随机和自然的积累优化基因。然而这种极低几率且无人类控制性的被动模式大大阻碍了农业的发展，迫切地需要一门新兴科学。自遗传学创立后改观了这一境遇，动植物育种采用人工杂交的方法进行优良基因的重组和外源基因的导入，从而实现遗传改良。 因此，转基因技术与传统技术在本质上都是通过获得优良基因进行遗传改良。但在基因转移的范围和效率上，转基因技术与传统育种技术区别于两点：首先，传统技术一般只能在生物种内个体间实现基因的转移，而转基因技术所转移的基因则不受生物体间亲缘关系的限制；第二，传统的杂交和选择技术一般是在生物个体水平上进行，操作对象是整个基因组，所转移的是大量的基因，不可能准确地定位于某个基因进行操作和选择，对后代的表型预见性较差。而转基因技术所操作和转移的是经过明确定义的基因，功能清楚，可准确预测后代。故转基因技术是对传统技术的发展和补充，两者的结合可以极大地提高动植物品种改良的效率。 在转基因发展的过程中，从早期单纯进行科研研究拓展到目前研究和应用齐头并进，生物学科与其他领域的交叉有着不可忽略的重要作用，如生物物理产生的显微镜技术，以及日益发展的电穿孔技术，极大地促进了科研走向应用。 在当今转基因领域中电穿孔技术的应用范围最广，早在1982年Neumann.E将外源DNA在电场条件下导入小鼠真核细胞[1]，从而实现了基因重组和外源基因的功能研究。随之这一技术得到了广泛的运用，如xx、酵母、植物和动物细胞的体外应用如Simon, J. R[2]；以及器官植入、皮肤损伤修复的电化学疗法、疫苗的注射等体内体外临床应用，如S.Tollefsen, et al[3]；小分子或大分子物质功能性研究；研制转基因动物、转基因植物新品种等，本文下文就将特别介绍转基因动植物的应用。 电穿孔技术主要包括电转染和电融合：电转染是利用脉冲电场将外源DNA导入细胞中，当细胞处于高压电场时，瞬时电脉冲可将细胞膜穿孔产生可逆性孔径，从而DNA进入细胞与染色体整合；电融合是利用高强度的电场脉冲，引起相邻的细胞融合 转基因植物 近些年来，面对全球环境剧变所引发的诸多农业问题，如耕地面积减少、空气质量下降等造成早期改良品种的方法已不合时宜，迫使转基因技术充分考虑各种因素，以达到人口不断增加对植物包括粮食及其他食品的需求。基因工程应用技术之一的基因重组，可用于不同生物遗传物质进行体外人工剪切、组合、拼接，使遗传物质重新组合，然后，通过载体，如微生物、病毒等转入微生物或细胞内，进行"无性繁殖"，并使所需基因在细胞内表达出来，产生人类所需的物质或创造新的物种。 近年来，国外已出现了一些"转基因作物"，如抗腐烂西红柿、抗除草剂棉花、抗病毒黄瓜和马铃薯，以及抗虫玉米等。这些都是运用转基因技术将目标基因转入受体植物体内，可用电转染方法、基因枪或者是传统的农杆菌侵染等。基因枪方法的效率较高但是价格昂贵；传统的农杆菌侵染易污染且效率低，外界不确定因素较多；相比较，大多数研究使用电转染方法获得转基因植物，如在James Saunders等利用BTX630电转仪得到转基因大豆 转基因植物可通过原生质体融合获得，有可能改变植物的某些遗传特性，不仅可以改良作物特性，还可培育高产、优质、抗病毒、抗虫、抗寒、抗旱、抗涝、抗盐碱、抗除草剂等的作物新品种。而且可用转基因植物或离体培养的细胞，来生产外源基因的表达产物，如人的生长素、胰岛素、干扰素、白介素2、表皮生长因子、乙型肝炎疫苗等已在转基因植物中得到表达。
1981年，{dy}次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。1982年获得转基因小鼠，转入大鼠的生长xx基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，因而被称为“超级小鼠”，这些开拓了转基因克隆动物–无性生殖技术。1997年英国I. Wilmut等，用绵羊乳腺细胞的细胞核移植到去细胞核的卵细胞中，成功得到了克隆羊“多莉”，证实了高等哺乳动物也可以突破有性生殖繁殖后代。 核显微注射法则是动物转基因技术中早期最常用的方法。它是在显微镜下将外源基因注射到受精卵细胞的原核内，注射的外源基因与胚胎基因组融合，然后进行体外培养，{zh1}移植到受体母畜子宫内发育，这样分娩的动物体内的每一个细胞都含有新的DNA片段。然而这种方法的缺点是效率较低、位置效应（外源基因插入位点随机性）造成的表达结果的不确定性、动物利用率低等，在反刍动物还存在着繁殖周期长，有较强的时间限制、需要大量的供体和受体动物等特点。 体细胞核移植是近些年来新出现的一种转基因技术。该方法是先把外源基因与供体细胞在培养基中培养，使外源基因整合到供体细胞上，然后将供体细胞细胞核移植到受体细胞——去核卵母细胞，构成重建胚，再把其移植到假孕母体，待其妊娠、分娩，便可得到转基因的克隆动物。在这一技术中，外源基因的稳定表达和重建胚的良好发育是关键因素，则选择合适的基因转染方式和细胞融合方式就显得尤为重要。 与传统的方法相比，电穿孔具有很多优点。首先，不必像显微注射那样使用玻璃针，不需要技术培训和昂贵的设备，可以一次对成百万的细胞进行注射。第二，与用化学物质相比，电穿孔几乎没有生物或化学副作用。第三，因为电穿孔是一种物理方法，较少依赖细胞类型，因而应用广泛。实际上，对大多数细胞类型，用电穿孔法基因的转移效率比化学方法高得多。已有多篇科研文献证实了电穿孔技术在转基因研究和临床研究上的作用，如Diego Laderach, et al[4]使用BTX ECM830以方波波形电击DC细胞，转染siRNA研究体内定位基因的功能，类似这种用以研究某基因的方法已相当成熟；以及Annelies E.P, et al[5]运用BTX ECM2001交流电排列细胞和直流电进行电击达到了目的基因的稳定表达和胚胎细胞的良好融合，最终得到转基因牛，等等。而BTX ECM2001细胞电融合&电穿孔仪已被美国xx实验室冷泉港列入标准实验操作程序。 |
