定量蛋白质组学研究的利器
——荧光差异凝胶电泳技术
齐连权 (通用电气医疗集团生命科学部,北京,100176)

自20世纪90年代后期,随着蛋白质组概念的提出和基因组测序工作的快速进行,尤其是双向电泳技术的改进和生物质谱的大范围应用,蛋白质组学研究进入了一个快速发展的十年.十年间,伴随着对蛋白质组分离技术分辨率和重复性的争论,以双向电泳为主的基于凝胶的分离技术和以反相色谱为主的
液相色谱质谱技术都取得了迅猛而深入的发展.
在科学家的争议声中,基于双向电泳的蛋白质组分析文献数量每年都在稳步增长,而其中在一些生
物技术公司和科学家的共同努力下,针对双向电泳的缺点而更新的技术也得到了更多科学家的青睐.
1975年,O`Farrell首次介绍了双向电泳技术,采用等电聚焦和SDS-PAGE在等电点和分子量两个方向上对蛋白质进行分离.20世纪90年代,法玛西亚公司推出了固相pH梯度胶条,极大地提高了等电聚
焦的重复性,使得国际上不同实验室间双向电泳实验结果比较成为可能.另外,双向电泳技术具有其他
任何分离技术无法比拟的高分辨率,可以看到相应蛋白质的等电点和分子量信息,对于蛋白质的翻译后修饰和Isoform也可以清晰展示.另外,近年来蓝染非变性电泳等技术也被用于双向电泳技术中高分子复合体的研究,扩展了该技术的应用领域.与电泳技术相关的蛋白质印迹技术
也为进一步研究蛋白质组中感兴趣的蛋白质提供了便捷的工具.然而,双向电泳的胶间差异仍然很大,即使应用现在很高级的双向电泳xxxx,仍然有很多蛋白质斑点无法正确匹配.更严重的挑战是即使那些匹配的蛋白点之间也无法确定其准确的定量关系.较大的系统误差导致该技术无法有效地区分系统误差和诱导的生物学差异,因此需要花费大量的时间和劳动运行重复胶以期得到更准确的定量结果.1997年,Unlu等发表了{dy}篇荧光差异凝胶电泳的论文,将不同的样品分别用不同的荧光染料进行标记后混合在同一块凝胶中进行双向电泳,极大地提高了实验结果的重复性和定量的准确性.2001年,Tonge等以小鼠肝脏作为实验材料,评价了该实验方法,并给予了很高的评价.
然而,这样的实验方法确切的说,仅仅是多通路荧光技术和双向电泳技术的初步结合,而并非真正
的荧光差异电泳(Ettan DIGE)技术.在安玛西亚公司(现在的通用电气公司)从Carnegie Mellon大学购买了该技术的专利后,该技术得到了系统地改进:包括增加了第三种荧光染料,专门研发了用于DIGE的
成像系统,xx的Typhoon系列激光共聚焦扫描成像系统;用于DIGE图像自动分析的DeCyder软件等,
这些都使得DIGE技术得到了更多科学家的认同,采用DIGE技术进行研究的科研论文的比重从2004年
的不到2%猛增到2008年的19.6%.
究竟是哪些创新和改进使得Ettan DIGE技术如此深受蛋白质组学研究者的喜爱呢？传统的双向电泳技术,分别在等电点和分子量两个方向上对蛋白质组进行分离,然而在第三个方向上,即定量准确性上并不尽如人意.Ettan DIGE技术通过有效的实验设计,xx的系统组件,内标的掺入等极大地降低了系统误差,提高了定量准确性,给双向电泳增加了第三个方向,确保了实验结果的高可信度.
DIGE的系统组成在双向电泳设备的基础上,还需要配置专门用于DIGE的荧光染

激光具有很好的单色性,非常适用于分别激发不同荧光染料,因此作为激光扫描成像系统,Typhoon系
列扫描仪被广泛应用于DIGE凝胶扫描中,相关的参考文献非常多(参见图2).Typhoon扫描成像系统专门为DIGE胶扫描进行了优化,扫描得到的胶图可以被相应的xxxx直接读取,其灵敏度可以达到银染灵敏度的10倍,而极高的动态范围和定量的准确性也为DIGE系统能够xx定量提供了硬件支持和保证.目前,市场上有多种双向电泳xxxx可以用于DIGE凝胶分析,而其中DeCyder软件始终是那些期望xx定量和准确分析的科学家的{sx}.DeCyder软件目前已经更新到第7版,其用于主成分分析,模式分析和判别分析的扩展数据分析模块作为标准配置被包含在该软件中(参见图3).DeCyder软件是整个DIGE平台的重要组成部分,其高效的胶间匹配,多种统计学分析方法的掺入给用户提供了简单,快速的结果提取平台.
实验设计的重要性相比的系统组成,DIGE的实验设计经常被科学家忽略.然而,建立在一个正确实验设计基础上的实验结果,可以用更少的凝胶得到更加准确和被同行认可的结果.DIGE技术可以让科学家运行更少的凝胶而获得更高质量的结果.一般来说,在进行普通双向电泳实验时,为了有效排除样品的个体差异和实验的系统误差,通常需要进行运行生物学重复和技术重复(即重复胶),以一个简单的例子来说明,如果现在要研究某种xx对小鼠肝脏蛋白质组的影响,需要2组各4只小鼠,分别注射xx及安慰剂,然后在某一时间点取肝脏抽提蛋白质组样品进行分析.如果仅仅运行4块重复胶的话,总共需要运行32块凝胶进行差异分析.而采用DIGE技术,
由于系统的误差减小,无需运行重复胶,8只小鼠的肝脏蛋白质可以分别运行在4块凝胶上即可以得到高质量的实验结果.由于凝胶数量减少了8倍,胶间差异得到了有效控制,找到真实的生物学差异的可
能性就被大大的提高了.
在实验设计中,一个重要的概念就是内标.Alban等{dy}次详细的阐述了内标的概念和意义.内标是将试验中所有样品取等量混合,用一种荧光染料(在最小标记染料中通常是Cy2)标记,并运行在实
验中的所有凝胶上.这意味着所有样品中的蛋白质都会被呈现在内标中.通过内标可以方便地对胶内不同荧光染料标记的样品和胶间样品进行归一化定量,而且不同凝胶之间的匹配变得异常轻松.Friedman等也通过采用内标的DIGE实验设计,对人直肠癌样品进行了系统研究,发现52个差异蛋白质中,有42个是在有内标的实验设计中才可能被发现.另外,在实验设计中,
还需要考虑样品的随机化原则等.针对上面的举例,如果把xx组设为A,安慰剂组设为B,小鼠的编
号为1～4的话,正确的实验设计应该是:
作为一个新的技术平台,Ettan DIGE技术正逐渐被广大科学家认可,2007年Frost&Sullivan将其2007
年技术创新奖授予了通用电气医疗集团,以表彰其将荧光差异凝胶电泳技术引进美国蛋白电泳市
场.而2008年,包括DIGE平台在内的通用电气的蛋白质和蛋白质组分离分析技术荣获了生命科
学工业成就奖.DIGE技术也不断被应用到很多研究领域,截至2008年5月,DIGE技术的应用文献已经多达1100余篇,平均影响因子为5.5.包括用于鉴定新药蛋白靶点,开发新的xx策略;可靠监测疾病的发生过程和xx过程;鉴定生物标记物用于早期诊断;xx分子机理或毒性研究;理解发育过程;植物蛋
白质组学,环境蛋白质组学等.已经成功分析的样品包括细胞培养物,
植物, xx, xx,海洋生物,动物模型样品,体液(如血液,脑脊液和唾液等),人的组织样品,病理切片,激光捕获显微切割(LCM)的组织和细胞等.