聚合酶链式反应技术（PCR）自1985年问世以来，以其灵敏性、特异性和快速性在医学和分子生物等领域得到广泛的应用，由此可见核酸扩增技术的重要性。近年来随着分子生物学的飞速发展以及生物物理技术的大量应用，新的核酸扩增模式也不断涌现。已经建立起来的方法大体可分为两大类，靶核酸的直接扩增与信号放大扩增。前者包括聚合酶链式反应（PCR）、链替代扩增（SDA）、连接酶链式反应（LCR）和依赖核酸序列的扩增（NASBA）等，这些方法都具有很高的灵敏度。信号放大扩增包括技术核酸（bDNA）、杂交捕获、侵染(Invader)和通过扩增替代分子来检测靶核酸等方法。而滚环增（RCA）是一种既能直接扩增靶核酸，又能实现信号放大扩增的方法。这些方法的区别见表1。

　　　　　　表1 不同核酸扩增技术的特性

    BDNA：枝状DNA,LCR：连接酶链式反应；NASBA：依赖性核酸序列的扩增；PCR：聚合酶链式反应；RCA：滚环扩增：RT-PCR：逆转录PCR; SDA: 链替代扩增；SNP：单核苷酸多态性：TMA：转录依赖的扩增；Invader:侵染检测技术
   
1   反应（PCR）
　　在DNA扩增方面,PCR一直是应用最广泛的方法。美国食品与与药品管理局（FDA）已经批准一些定量检测病原体的PCR诊断试剂盒（Roche）,如HIV、结核分枝杆菌、沙眼衣原体等。研究报道这些试剂盒的应用结果优于bDNA、NASBA扩增技术。
　　最近，PCR技术的{zd0}突破就是对单管PCR产物进行实时荧光定量检测，该方法提高了灵敏度与特异性，并且易于操作。如TaqMan就是采用这种技术，两端分标记有荧光与淬灭基团的寡核苷酸探针结合到PCR产物上后，其淬灭基团被具有5´-3´外切酶活性的Taq DNA聚合酶切掉，从而产生荧光，通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进生定性和定量。
　　TaqMan技术另一种应用就是分子灯标（molecular beacon）。分子灯标为一茎环状结构的寡核苷酸探针，其环状区核苷酸序列与靶核酸互补，靠近两端的部分序列互补构成分子灯标的茎部，两末端分别标记荧光基团与淬灭基团。没有靶核酸存在时，分子标保持茎环结构，荧光工团与淬灭基因距离较近，产生的荧光能量根据荧光共振能量转移原理转移到淬灭基团，并以热能的形式散发出去，从而检测不到或仅有微弱荧光本底。当靶核酸存在时，茎部结构由于环状部分结合靶序列而被打开，荧光基团与淬灭基团分开，荧光产生。此技术已经应用于结核及大肠肝菌O：157的检测。
　　Amplifluor是分子灯标的另一种形式，以引物的形式用于PCR，其5´端为茎环状结构并标记有荧光基团与淬灭基团，当Amplifluor被掺入到扩增产物中后，其茎环状结构被打开，产生荧光。Jordens等人将其应用于HPV的分型检测。同TaqMan中的分子灯标相比，Amplifluor技术不足之处是不能区分特异性与非特异性的PCR产物。Scorpion为一修饰的Amplifluor，可以降低本底而优于TaqMan和分子灯。三种形式的分子灯标在应用方面的不足之处就制备较困难，成本较高。

2   连接酶链式反应（LCR）
    在LCR中，一对寡核苷酸探针杂交到靶DNA的相邻序列上，之间形成的缺口被连接酶所连接，再由连接产物的引物进行温度循环扩增。此方法的{zd0}优点就是可用检测基因突变。FDA已批准该类试剂盒 用于检测沙眼衣原体，具有与PCR一致的检测灵敏度。
    LCR最近也被应用于微阵列芯片。靶核酸被杂交捕获后，等位基因特异性的探针被连接到一荧光标记的探针，等位基因特异的探针在5´端有一段外加序列用来捕获DNA微阵列上的LCR产物，从而对带有荧光的产物进行测定。这种技术结合了液相LCR的特异性与通用型阵列的多重性，进一步拓宽了LCR的应用。
    3   链替代扩增反应（SDA）
    little M等人结合SDA与实时荧光发了新一代DNA探针系统，即BDProbeTecET。采用标记两种不同荧光基团的探针，在SDA过程中，该探针被掺入到双链扩增产物中，由限制内切酶的酶沏使淬灭基团与荧光基团分开，从而释放荧光。此系统用于病原体的检测，{zd1}可检测到10-15个脑膜炎双球菌或沙眼衣原体。
    Westin L等人将SDA扩增技术应用于微电子芯片中，在一个电场中，生物素标记的引物被固定到微阵列上，另一电场中，靶核酸被杂交捕获，并在原位进行SDA反应，产物在电场作用下被定引物捕获。尽管扩增与杂交捕获过程中有信号丧失，但还是可以达到一定的灵敏度（104拷贝）。
    4   依赖核酸序列的扩增（NASBA）
    NASBA主要用来检测HIV的病毒载量，最近不同实验小组将其与其它检测方法比较得出了不同的结果，看来对该方法有待进一步的评价。
    5   转录介导的扩增（TMA）
    TMA是一种利用RNA聚合酶和逆转录酶等温反应条件下来扩增RNA或DNA的系统。主要产品为Gen-Probe,其检测沙眼衣原体与结核分枝杆菌的试剂盒已得到FDA批准上市。最近研究表明，该方法用于HIV的定量检测，灵敏度高于RT-PCR和bDNA方法。
    6   枝链核酸信号放大系统(bDNA)
    该系统是目前本实验室的在研课题，其信号放大是通过碱性磷酸酶（AP）标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。在条件稳定的情况下，其检测灵敏度主要取决于信号的显示体系。Chiron公司采用AP的发光底物1，2-二恶二酮（dioxetane），用发光检测仪来测量其发光强度，灵敏度大大提高。
    尽管RT-PCR是{wy}FDA批准用来定量分析血清HIV的技术，但bDNA方法在临床实验室也是经常利用的，并且最近的研究报道Bdna3.0在线性范围上（100-500000拷贝/毫升）优于RT-PCR。BDNA技术应用的{zd0}限制就是灵敏度不够高（与PCR相比）。为了解决这个问题，Capaldi等人将DNA枝状体作为一个反应平台，结合到技状体上的寡核苷酸在DNA聚合酶作用下延伸和外切，产生大量的无机焦磷酸（ppi）,在酶促作用下ppi可转变为ATP，ATP可通过荧光素酶酶促产生荧光信号来定量。此方法灵敏度可达到5zmol(10-21mol),接近于PCR。
    7   杂交捕获
    Digene公司建立起来的这种方法的原理是将DNA-RNA的杂交信号在固相载体上转化为免疫结合，由标记AP的抗体介导产生化学发光信号。被FDA批准的该类型试剂盒有淋球菌、沙眼衣原体和巨细胞病毒，并且是{wy}被批准用来检测人类乳头瘤病毒DNA（HPV-DNA）的试剂盒。
    8   DNA裂解信号放大
    在环状探针技术中（cycling probe technology, CPT）,探针为一含DNA-RNA-DNA的嵌合体，两端分别标记生物素与荧光蛋白，结合到靶核酸上后，RNA部分被RNA酶（H）降解，两端DNA部分脱落下来，同时靶核酸可继续用来结合探针。反应后的体系在包被有链亲合素与蛋白G抗体的高流速硝酸纤维素膜上层析，如果没有靶核酸存在，完整的探针结合上胶体金-抗荧光蛋白接头，被包埋的链亲合素捕获后产生一条检测线，反之则没有。最近该技术有用于耐甲氧苯青霉素的金黄色葡萄球菌与耐万古霉素的肠道微球菌的检测。
    侵染探针（Invader）技术为另一种DNA信号放大分析。它是依据AFEN1酶的酶切特性来设计上、下游引物，上游引物的全部序列与下游引物（信号探针）的3´部分序列可与靶核酸的一段连续序列杂交结合，这样下游引物的5´端就如同在上游引物的侵入下而呈翼状探出，进而被FEN1酶切下，分析酶切片段可确定有无靶核酸的存在。Hall等人使酶切下来大片段与按同样原理设计的分子灯标结合，后者经FEN1酶切后荧光基团与淬灭基团分开，产生荧光。其检测灵敏度可达1000拷贝（靶核酸）以下。
    该技术还可应用于单核苷酸多态性分析（single nucleotide polymorphism,SNP）,因为碱基错配可抑制FEN1的酶切。用于基因突变的研究报道结果与等位基因特异性PCR一致。
    9   滚环扩增（RCA）
    RCA既可进行靶核酸扩增，也可进行信号放大扩增。有线性与指数两种形式的RCA。线性RCA是引物结合到环状DNA上后，在DNA聚合酶作用下被延伸。产物是具有大量重复序列（与环状DNAxx互补）的线状单链。线性RCA用于靶核酸扩增xx于一些具有环状核酸的病毒、质粒和环状染色体。
    Schwetizetr等人建立了免疫RCA，引物的5´端标记有抗体，抗原抗体反应后，加入RCA反应组分与环状DNA模板进行RCA，然后标记有荧光素的探针与RCA产物原位杂交，{zh1}对荧光信号进行检测，该方法的灵敏度可达0.1pg/ml。
    指数RCA原理与线性RCA相同，采用与环状DNA序列xx一致的第二种引物，该引物与{dy}次线性RCA产物结合并酶促延伸，其产物又作为{dy}种探针的模板，这样一来在很短的时间内（1h），产物呈指数递增。Thomas等人证实其灵敏度可达到10拷贝，在1h内产物达107倍。
    指数RCA可用于非环状DNA的扩增，设计一引物，其两端可结合到一段连续的序列上，并形成缺口，在连接酶作用下，引物被连接成环状。此环状引物可作为RCA的模板，进行指数扩增。此方法特异性很高，可用于突变与SNP的检测，若与荧光实时检测系统结合起来，其应用前景将是很广的。
    10 纳米颗粒（nanoparticles）
    纳米材料是具有纳米介观尺度（0.1-100nm）的均匀的有机或无机分子。按一定方法合成的均匀的胶体金颗粒在该领域一直是倍受青睐的，此纳米粒子在免疫标记领域已占有一席之地，并发挥着巨大的作用。
    胶体金颗粒可与生物大分子表面的还原性的疏基结合。人工合成的寡核苷酸探针经疏基修饰后就可被胶体金颗粒标记上，可用于固相核酸杂交的信号显示。液相杂交中，通过胶体金标记的寡核苷酸探针与靶核酸的结合，使得胶体金颗粒聚集在一起而呈现颜色反应，根据颜色变化可判断靶核酸的存在与否。
    直径介于纳米水平的胶体金颗粒和半导体材料都具有一定的光学、电子学和材料学特性，这些特性使得其在化学传感器、分光光度、量子斑点、缩微图象以及纳米结构构建等领域的应用非常广泛。胶体金纳米颗粒用于核酸杂交检测也是本实验室在研课题之一，相信它将会同其它纳米材料一样在纳米科技领域发挥重要作用。

　　　　　　　　　　　　　　　摘自：《国外医学临床生化学与检验学分册》2002年第23卷第1期