河北大学细胞生物学实验室
细胞培养
细胞培养(cell culture) 的含义,简单地说即是把来自机体的组织经分散成为单个细胞,放在类似于体内的体外环境中生存,使其不断生长、繁殖或传代,借以观察细胞的生长、繁殖、衰老等生命现象.细胞培养技术在遗传学、免疫学、肿瘤学、病毒学、分子生物学等领域已得到广泛的应用. 可分为原代和传代培养两种方式.
原代培养
用直接从机体获得的细胞进行的培养称为原代培养.这种培养过程主要是采用无菌操作的方法,把组织(或器官)从动物体内取出,经酶消化处理,使分散成单个细胞,然后在人工条件下培养,使其不断地生长和繁殖.原代培养是建立各种细胞系的{dy}步.
动物细胞原代培养过程图
方法与步骤
(1)动物处死:将出生2~3d乳鼠,用拉颈椎方法处死.背部向上钉在蜡盘中,用碘酒和酒精棉球擦拭腰部两侧被毛.(2)取肾及剪肾:在无菌条件下将肾脏取出,置于无菌培养皿中,剪去肾膜和脂肪,用Hanks液洗涤1次;放入另一培养皿中,纵向剪开肾脏,去掉肾盂,将肾剪成1mm3大小的块,再并用Hanks液洗涤2~3次,直到液体澄清.
(3)消化及分散组织块:将上述清洗过的组织放入无菌青霉素瓶内,加入5~6倍量的0.25%胰蛋白酶液(pH7.4 ~ 7.6),置37℃水浴中消化20 ~ 40min,每隔10min摇动一次,直到组织块变得疏松,粘稠,且颜色略变为白色为止.取出青霉素瓶,在超净台中吸去胰蛋白酶液,加入5ml培养液,用吸管反复吹打组织块,使其分散成细胞悬液,将细胞悬液用两层xx纱布过滤至另一烧杯中.
(4)计数与稀释:从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于血细胞计数板上,按白细胞法进行计数;计数后用培养液稀释,稀释后的浓度一般以每毫升含30 ~50万个细胞为宜.(5)分装与培养:将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中,塞紧瓶塞,在培养瓶上做好标记,置于37℃的CO2培养箱中培养.(6)观察:逐日检查培养物是否污染,观察细胞生长情况.待细胞已基本长成致密单层时,即可进行传代培养.
传代细胞培养
离体培养的细胞群体增殖达到一定密度时,细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止,如不及时分离传代培养,细胞将逐渐衰老死亡.传代培养是指细胞从一个培养瓶以1:2或其他比率转移,接种到另一培养瓶的培养.贴壁培养细胞的传代通常是采用胰蛋白酶消化,把细胞分散成单细胞再传代,而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代.
方法与步骤
(一)贴壁细胞传代培养(1)选取生长良好的细胞,在超净工作台的酒精灯旁,倒去瓶中的旧培养液,加入2~3ml的D-Hanks液,轻轻振荡漂洗细胞,以除去悬浮在细胞表面的碎片.(2)加入2滴管0.25%胰蛋白酶消化液,37 ℃消化2~3min,倒置显微镜下观察,待细胞单层收缩突起出现空隙时,倒去酶液.(3)用Hanks液洗涤1次,加入1~2滴管培养液,反复吹打细胞,使其成细胞悬液.(4)以1:2或1:3进行分装,并在培养瓶上做好标记,注明代号、日期,轻轻摇匀,37 ℃CO2培养箱培养. (5)观察:细胞培养24h后,即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况.
(二)悬液细胞的传代培养(1)取生长良好的细胞,在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀.(2)转移到无菌的离心管中,盖紧胶盖,平衡后离心(1 000r/min)5min.(3)在超净工作台中吸去上清液,加入适量新培养液,用吸管吹打细胞,制成悬液.(4)以1:2或1:3进行分装,并在培养瓶上做好标记,注明代号、日期,轻轻摇匀,37 ℃CO2培养箱培养.(5)观察:细胞培养24h后,即可进行观察.