实验目的

１．学习氨基酸纸层析的基本原理

２．掌握氨基酸纸层析的操作原理

实验原理

转氨基作用是氨基酸代谢过程中的一个重要反应。在转氨酶的催化下，氨基酸的α－氨基与α－酮酸的α－酮基的互换反应称为转氨基作用。每种转氨基反应均由专一的专氨酶催化，转氨酶广泛分布于肌体各个组织和器官。

本实验用纸层析法观测α－酮戊二酸与丙酮酸在肝脏丙氨酸氨基转移酶（ALT）催化下的转氨基作用。

实验组发生转氨基反应，在{zh1}的体系中才存在两种氨基酸；而对照组不发生转氨基反应，{zh1}体系中只有反应物中的一种氨基酸，用煮沸方法是得ALT失活而中止反应，然后用纸层析法对两种氨基酸进行分离鉴定。

纸层析按操作方法分成两类即垂直型和水平型。垂直型是将滤纸悬挂，使流动向上或向下扩散，水平型是将圆形滤纸置于水平位，溶剂由中心向四周扩散。纸层析法的分离原理是分配层析，分配层析是利用混合物在两种或两种以上的不同溶剂中的总分配系数的不同而使物质分离的方法，相当于一种连续的萃取过程。

纸层析以滤纸为支持介质，水被吸附在滤纸的纤维素的纤维之间形成固定相。某些与水不相溶的有机溶剂如醇、酚等为常用流动相。把预分离的物质夹在指的一端，使流动溶剂经此向另一端移动，这样物质随着流动相的移动进行连续，动态的不断分配。由于物质分配系数的差异，而使移动速度就不一样，在固定相中分配趋势加大的组分，随着流动相移动的就慢；反之，在流动相分配趋势加大的成分，移动速度就快，最终不同的组分彼此分开。物质在纸上的移动速度可以用比移值（Rf）表示：

物质在在一定的溶剂中的分配系数是一定的，故必移值也相对恒定，因此在同一层析体系中可以用Rf值来鉴别被分离的物质。

用纸层析分离氨基酸混合物时，影响RF制的主要因素是侧链基团的极性。例如丙氨酸侧链极性要小于谷氨酸侧链的极性，所以在混合物中丙氨酸在滤纸上运动要快。Rf值大，而谷氨酸在滤纸上的运动速度要慢，Rf值小。

1 实验材料和仪器

1 仪器 剪刀；镊子；托盘；培养皿；毛细管；喷雾器；吹风机；水浴箱；电炉。

2 试剂

（1）pH 7.4 0.01 mol/L磷酸缓冲液；取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液81 ml和0.2 mol/L磷酸二氢钠19ml混匀，用蒸馏水稀释20倍。

（2）0.2 mol/L丙氨酸溶液：称取并氨酸0.891g先溶于少量pH 7.4 0.01 mol/L磷酸缓冲液，以1mol/L氢氧化钠仔细调节至PH 7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。

（3）0.1mol/L α-酮戊二酸溶液：称取α-酮戊二酸1.461g，先溶于少量的pH7.4 0.010 mol/L磷酸缓冲液中，以1mol/L氢氧化钠仔细调节至PH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。

（4）0.1mol/L谷氨酸溶液：称取谷氨酸0.735g先溶于少量的pH 7.4 0.01 mol/L磷酸缓冲液，以1mol/L氢氧化钠仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至50ml。

（5）0.5%茚三酮溶液：称取茚三酮0.5g溶于100ml丙酮中。

（6）层细溶液（酚的饱和溶液）：将重蒸过的酚2份和水1份（按重量计算）混合后，放入分液漏斗中，振荡，静置24小时分层，将下部酚层转移到瓶中备用。

2 实验步骤

1．肝均浆制备：取新鲜的动物肝0.5g，在研钵中剪碎，研成均浆，加入9倍体积（4.5 ml）pH 7.4 0.01 mol/L磷酸缓冲液。

2．转氨基反应：取干燥小试管（或离心管）二支，分别标明测定管与对照管，加入肝均浆10滴，测定管加入37℃水浴保温10分钟，对照管放入沸水中煮10分钟，待对照管冷却后，于两试管中分别加入0.1mol/L谷氨酸10滴，0.1mol/L α-酮戊二酸10滴，pH7.4 10 mol/L磷酸缓冲液1.5ml，摇匀，放进37℃水浴保温30分钟，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮熟10分钟，以终止反应，去除冷却后，过滤。取滤液备用。

3．层析：取直径9cm圆形滤纸一张，用圆规作半径1cm同心圆，通过圆心作两条相互垂直的线（见图１），在2、3两处分别点测定管和对照管上清液1-2滴。方法是用毛细管在纸上点样，注意斑点不可太大（一般直径0.5cm）而且每点一滴需干燥后方可点第二滴，在2、4两处则各加0.1mol/L丙氨酸和0.1mol／L谷氨酸1-2滴。

在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小）另取同类型滤纸约1cm2,下剪成须状，卷成圆筒，如灯芯，插入小孔（勿使突出滤纸面）。

将层析液放入直径3-5cm的表面皿正中，（表面皿放入直径9cm的培养皿正中）将滤纸平放在培养皿上，灯芯浸入溶液中，将另一同样大小的培养皿反盖上（见图2），可见溶液沿灯芯上升至滤纸，再向四周扩散，约25分钟后，溶液前缘距滤纸边缘约１cm时即可取出，用吹风机吹干或60℃烘箱烤干。

４．显色：将上述滤纸平放在培养皿上，用喷雾器喷上0.5%茚三酮的丙酮溶液，使滤纸全部浸润，再用吹风机或60℃烘箱干燥，此时可见紫色斑出现，比较色斑的位置及色泽深浅，计算Rf值，分析是否发生了转氨基反应。

注意事项

１.层析液中含有腐蚀性酚，取用时注意安全，防止溅到皮肤及眼睛。

２.操作中接触滤纸前要洗净手，并尽量避免手与滤纸中间部位接触。

３. 点样不宜过大，直径小于0.5cm.