二、 质量研究一般来讲，多糖的质量研究主要包括各组分的理化性质如溶解度、比旋度和粘度的测定，分子量及分子量分布的研究，平面和立体的化学结构分析，结构改造和结构修饰的研究，以及糖醛酸、蛋白质、单糖和多糖的含量测定等等。下面简单介绍多糖的结构、分子量及分子量分布以及含量测定等方面的研究进展。 1、结构分析目前在多糖一级结构的分析中大多采用化学方法与物理方法相结合,可基本阐明某一多糖的一级结构的大致特征。而目前用于多糖高级结构分析的方法主要是物理方法, 诸如 X-射线纤维衍射、核磁共振、电子衍射等。如上所述，多糖的一级结构本身就很复杂。由于多糖结构的微观不均一性, 或结构键中有缺陷, 或是分子量分散, 使多糖的一级结构分析难以得出xx正确的结构式。多糖结构的描述包括:①多糖的分子量范围；②多糖的单糖组分；③单糖的连接点类型；④单糖和糖苷键的构型；⑤重复单位。多糖的活性与其初级和高级结构密切相关,高级结构在活性方面比一级结构起更大作用。有些多糖一级结构相同, 但活性不同, 其原因是二级及三级结构不同。目前多糖的立体结构研究一般靠 2D-NMR及X-衍射法。除此之外, 多糖的活性还与分子量、溶解度、粘度等理化性质有关。在研究多糖的构效关系时, 常用到多糖的分子修饰, 对多糖进行化学修饰,如硫酸化、脱硫酸化、化学降解、酶降解、乙酰化、烷基化等等, 有助于深入探讨其构效关系。下面将简单介绍化学方法和物理分析方法。（1）化学方法测定多糖结构还是目前最常用的方法，测定的手段很多，其中经典而有效的是甲基化分析、高碘酸氧化和Smith降解、部分酸水解以及乙酰解和甲醇解等。 ①甲基化分析 甲基化分析是多糖也是寡糖结构分析的最有力的手段之一。它包括糖的所有自由羟基全部生成甲醚，接着通过水解释放出甲基化单糖，再经NaBH4还原成糖醇，进而乙酰化水解后生成的羟基，得到各种部分甲基化的糖醇乙酰衍生物，生成的产物用气相色谱进行定性和定量分析，可确定组成多糖的各单糖种类和比例，进而用气相色谱—质谱，结合标准谱图的分析，可得到各种部分甲基化单糖衍生物的归属，从而确定各单糖的连接位置，即糖苷键的位置。但甲基化分析还无法知道异头碳糖苷键构型及多糖中单糖残基的顺序信息， 所要注意的是对含有糖醛酸或氨基己糖残基的多糖比较难甲基化，而且有可能会产生二级产物，如糖醛酸残基能产生缩酮衍生物，N—乙酰基氨基己糖残基可产生N—甲基 -N-乙酰氨基己糖，对这些衍生物需要特殊分析技术才能鉴定。 ②过碘酸氧化及Smith降解 多糖的过碘酸氧化反应通常在pH3-5的水溶液中进行，用过碘酸盐为氧化剂，因双醛型的氧化产物在水中不稳定，因此需要在酸水解前用NaBH4将它们还原为醇，{zh1}，通过水解产物的分析结果可获得多糖中单糖连接的类型是l→4，1→-6，1→2，还是各种连接兼而有之。 Smith降解实际上是一种改良的过碘酸氧化，它是将多糖过碘酸盐氧化，NaBH4还原后用弱酸部分水解 (通常在室温下用稀无机酸水解还原产物)，生成具有特征性的糖连接的重复单元，从而获得更多的结构信息。 ③部分酸水解这是多糖结构分析中一个很有用的技术，一是通过部分酸水解可以获得结构较为容易测定的短链片段，从而集零为整推断出多糖的结构。二是可以在特殊糖苷键处断裂，帮助整个结构分析。如呋喃环结构的单糖对酸不稳定，用弱酸水解 (就可以得到这些残基，再通过残基片段的分析可得到有用的结构数据。一个成功的例子是枸杞子糖蛋白中一条由阿拉伯糖和半乳糖组成的O—连接多糖，并从甲基化分析结构得知，该多糖的非还原末端均为呋喃环阿拉伯糖，通过部分酸水解并用纸层析跟踪检测，首先释放出Ara，到刚有Ga1释放时终止水解，通过水解前后两种多糖的甲基化分析结果比较，再结合其他方法测得的结果可推断出整个多糖的可能结构。 ④乙酰解和甲醇解 乙酰解：多糖的乙酰解反应是在由乙酸酐、乙酸和硫酸组成的混合液中加热进行的，在一定的糖苷键处裂解。研究表明，相同糖苷键在酸水解和乙酰解中的速度是不同的。乙酰解是酸水解的一种有用的补充，多糖可从这两种不同的方法中获得不同的片段，从不同的角度获得多糖的结构信息。甲醇解：多糖在80-100℃条件下与无水甲醇氯化氢反应能将多糖变成组成单糖的甲基糖苷，这些甲基糖苷能转化为三甲基硅醚衍生物或乙酰基衍生物，然后进行GC分析并与标准单糖对照，可得到组成多糖的各单糖的定量数据。（2）物理分析法 ①IR法：IR在多糖结构分析上主要是确定吡喃糖的苷键构型，以及常规观察其他官能团。一般主要观察730-960cm-1的范围，如对于α-吡喃糖，δC1-H在 845 cm-1，而β-吡喃糖，δC1-H在890cm-1有{zd0}吸收峰。 ②MS、GC-MS：GC分析多糖虽受样品挥发性和热稳定性的限制，但GC-MS是多糖结构分析不可缺少的工具，特别是对水解单糖、甲基化单糖及甲基化寡糖的分析，而且能鉴别出糖的异构体。MS在多糖结构分析中不仅在鉴别各种甲基衍生物的碎片，确定各种单糖残基的连接位置时必不可少，而且由于FAB-MS、ESI-MS和 MALDI-MS等技术的出现，利用质谱还可以测定多糖的分子量及一级结构。 ③NMR：用NMR技术研究多糖结构的一个特点是不破坏样品，对多糖的结构特征可通过化学位移、偶合常数、积分面积、NOE及驰豫时间等参数来表达。一维、二维图谱 NMR在分析糖的构型、相互连接的位置及顺序等方面具有广阔的应用前景。 2、分子量及分子量分布多糖具有分子大小不均一的特点，近年来发现这些生物大分子的某一分子量范围成分具有药理活性，而另一分子量范围的成分不具有药理活性或具有一定的毒副作用，因此分子量及其分布既是这类xx的有效性控制的指标又是安全性控制的指标，质量标准中制订该项检查十分必要，这也是近年来大分子聚合物xx质量标准发展的一个明显的特点。多糖分子量只是代表相似链长的平均配布，不同方法所测得的分子量不同，即使是同一多糖，其重均分子量与数均分子量也相差较大，通常采用凝胶色谱法控制这类xx的分子量及其分布，应经研究选用与供试品分子大小相适应的色谱柱填充剂；使用的流动相通常为水或缓冲液，其pH值不应超过填充剂的耐受范围，可加入适量的有机溶剂，但浓度不应超过30%，流速以 0.5-1.0ml/min为宜，因这类分子多无紫外吸收，一般采用示差折光检测器，选用对照品的分子量范围及颗粒形状应与供试品匹配，测定数据经适宜的GPC软件处理求得相关参数。 3、含量测定一般来讲，多糖不含蛋白和氨基酸，蛋白或氨基酸检测应呈阴性或符合限度检查要求，如为糖蛋白或糖肽，应提供其证据，以保证产品不是多糖与蛋白的混合物；并提供其氨基酸构成及蛋白含量范围，以保证质量稳定可控。对从xx植物中得到的多糖, 在结构研究中尤其对糖组成分析, 确定其中是否含有糖醛酸残基具有很重要的意义。糖醛酸的含量测定目前较常用的是硫酸咔唑法，但容易受中性糖残基的干扰。为了xx测定的干扰，可先测定样品中中性糖的吸收度，然后从样品的吸收度减去中性糖的吸收度，即为样品中糖醛酸的吸收度值。间羟基联苯法也是一种常用的多糖中糖醛酸含量测定方法,该法较硫酸咔唑法受中性糖残基的干扰更小。多糖的含量测定可分为两大类： 一类是直接测定多糖本身, 如高效液相色谱法和酶法；另一类是利用组成多糖的单糖缩合反应而建立的方法，如苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等。前者需要多糖的纯品和特定的酶，后者测定时方法学干扰较大，现有的比色重现性差，受影响因素多。但由于目前国内的实验条件，多糖的含量仍然主要采用这种方法，其原理为：多糖在浓硫酸水合产生的高温下迅速水解，产生单糖，单糖在强酸条件下与苯酚反应生成橙色衍生物。在波长490nm左右处和一定浓度范围内，该衍生物的吸收值与单糖浓度呈线性关系，从而可用比色法测定其含量，所用的单糖对照品尽量采用与其多糖组成一致或为含量较高的单糖，这样测得的值较准确。需要强调的是，这种方法所测定的是总糖的含量而不是总多糖的含量，因此首先应测定样品中游离的单糖含量，然后将总糖的含量减去游离单糖的含量，即为总多糖的含量。另外还可以采用3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法），它是在碱性条件下显色，较准确测定还原糖与总糖的含量从而求出多糖的含量，可xx还原性杂质的干扰。