0引言

　　红细胞花环形成试验（rosette assay）中被检细胞处于生长状态，表面抗原表达密度较高，并保持在一种xx分子的构象，因此与免疫组化方法相比，敏感性高,特异性好. 在用肿瘤细胞或新鲜组织为免疫原制备和筛选mAb中有很大的应用价值［1］. 我们对花环形成试验在肿瘤膜抗原mAb制备上的应用进行了探讨，并与间接免疫荧光染色和流式细胞术分析的筛选方法进行了比较.

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　　1 材料和方法

　　1.1材料

　　COLO205, CACO2, SW480（结肠癌）,HEP2（喉癌）,HHCC（肝癌）,WISH（人羊膜上皮）均为本室保存的细胞系，复苏后用100 mL/L FCS的RPMI1640培养. 检测时用60孔小盘（NUNC）培养细胞；兔抗鼠的多抗血清购自DAKO公司； CrCl3用0.15 mol/L NaCl配制成10 g/L,调整pH值到4.0，作为储存液避光保存，用前稀释成0.1 g/L. Alsevers 液，PBS以及巴比妥缓冲液（VBM）.

　　1.2方法

　　抗体标记红细胞按文献［1］稍加改良. 将新鲜的O型抗凝血与等量的Alsevers 液混合，取适量的细胞悬液置于有VBM的离心管中，在4℃下离心3次，分别为1000, 1500, 2000 r/min，各5 min，再用冷的生理盐水洗涤2次，吸尽上清. 将红细胞(压积)、生理盐水和兔抗鼠的血清按1∶1∶1的体积比混匀. 逐滴将10倍于红血球压积的0.1 g/L的CrCl3加入重悬后的红细胞中. 轻轻摇晃5 min，使红细胞保持在悬浮状态,在CrCl3作用下与抗体充分的交联，加入VBM终止反应，并用VBM将交联后的红细胞洗涤3次，用10倍于红血球体积的VBM将红细胞重悬作为指示细胞，4℃可保存2 wk. 将检测使用的贴壁细胞以合适的密度移入60孔小盘中，细胞数目约为500个/孔. 细胞的密度与其贴壁后的大小和形状有关，在选择细胞时也应该尽量用贴壁性能较好的细胞，37℃培养过夜. 将20 mL/L FCS PBS洗液10 mL加入60孔小盘中，在摇床上洗3～5 min，用纱布或纸巾轻轻蘸干. 在每个小孔中加入10 μL的待测上清或不同稀释度抗体稀释液，室温孵育1 h. 蘸干后用洗液洗2，每次5～10 min，蘸干. 将已标记了抗体的红细胞用洗液稀释50倍后，轻轻吹匀，在每个小孔中加入20 μL. 在室温静置45 min，用洗液洗2～3次. 在显微镜下观察每个小孔中待测细胞周围红细胞花环的形成情况. 50%以上细胞有花环形成被判定为阳性孔.

　　抗体的制备及筛选: 用结肠癌的细胞系SW480免疫BALB/c小鼠,取小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合. 用花环法检测阳性的杂交瘤细胞的上清和克隆化过程中阳性克隆上清，得到3株结肠癌细胞相对特异性的杂交瘤细胞，分别命名为2B9, 4A9和6A8. 阳性克隆上清与SW480和/或CACO2细胞可形成红细胞花环，而与HEP2, HHCC, WISH等细胞不形成花环.

　　2结果

　　以SW480为待测细胞，以antiHLAⅠ类分子和antiSED的抗体分别为阳性和阴性对照抗体，阳性孔中可见待测细胞周围由红细胞围绕形成花环(图1A)，而相应的阴性对照孔中则看不到相应的待测细胞周围的花环形成(图1B). 取杂交瘤细胞2B9的培养上清，用洗液稀释，得到原液、1∶3, 1∶9和1∶27 4个稀释度,分别用花环试验以及间接免疫荧光染色和流式细胞术分析（FCM）检测其与细胞膜抗原的反应性［2］. 结果表明，在FCM中当杂交瘤上清稀释度为 1∶9 时，阳性细胞百分率从原液的38.6%下降到4.2%,当稀释度为1∶27时FCM则为阴性. 而在红细胞花环试验中，当杂交瘤培养上清稀释至1∶27时，仍可见有阳性花环细胞（图2）.

　　3讨论

　　目前用于xx肿瘤的mAb主要是针对肿瘤细胞膜特异性或相关的抗原，如抗CD20, Her2, EpCAM等mAb. 因此制备识别肿瘤细胞的膜表面肿瘤抗原的mAb，具有重要的应用价值. 由于肿瘤细胞的表面抗原的抗原性较弱，因此，建立高敏感性和特异性的筛选方法成为肿瘤单抗制备的关键. 红细胞花环形成试验用于肿瘤组织及细胞特异的mAb的检测已有成功报道［3］，但应用仍不普遍. 本结果表明，利用红细胞花环形成试验可以有效地从融合后的杂交瘤细胞培养上清中筛选出阳性克隆，其敏感性明显高于目前常用的FCM和细胞ELISA等方法. 由于细胞膜上相应抗原表达水平可能较低，或者表达相应抗原的细胞可能只占细胞群的一部分，因此在实际的操作中阳性的判断主要依靠与阴性对照孔的比较，以及同种细胞对不同抗体检测时的综合判断.

　　【参考文献】

　　［1］ Coombs RRA, Scott ML, Cranage MP, et al. Assay using red celllabelled antibodies［J］. J  Immunol Med, 1987;101(1):1-14.

　　［2］金伯泉，户义，刘雪松，等. 细胞和分子免疫学实验指南［M］.   西安:  第四军医大学出版社,2002:78-80.

　　［3］Ritter G, Cohen LS, Welt S, et al. Serological analysis of human antihuman antibody response in colon cancer patients treated with repeated doses of humanized monoclonal antibody A33［J］. Cancer Res, 2001;61(18):6851-6859.