无论你的实验需要标记的一抗，二抗或者其它扩增信号的方法，我们都有办法保证为你提供可用于每一种用途和仪器的最明亮的耦联物。

每一个免疫标记实验都会发现各种各样的问题。在多重技术应用中，你或许需要改变荧光染料或半抗原标记，以发现正确的匹配；你或许仅有极其微量的抗体来标记耦联；你或许需要显著的信号扩增来检测低丰度靶点的免疫标记……希望本篇抗体标记指南能够对您有所启迪。
采用Alexa Fluor 染料标记一抗
尽管二级检测方法能够提供显著的信号扩增，然而直接标记的一抗通常可以产生较低的背景荧光和更少的非特异性结合。此外，当一抗被直接标记后，多个同种型（isotype）或来源于同一物种的一抗能容易地被应用在同一实验中；这样，在没有二级检测方法提供信号扩增步骤的情况下，使用可以获得的最亮的荧光标记的一抗变得比以往更加重要。Alexa Fluor染料是一系列的非常明亮并且光稳定的荧光基团，光谱可以跨越从蓝光到远红外光（图1，表1）。此外，这些染料已经被仔细的挑选和优化，以便具有极好的水溶解性，最小化的染料间的相互作用，并且容许较高程度的标记单克隆抗或多克隆抗体。除了具有可广泛选择的氨基反应Alexa Fluor 染料外，我们还提供三种类型的Alexa Fluor染料标记抗体试剂盒——Zenon IgG 抗体标记试剂盒，AlexaFluor蛋白标记试剂盒, 和Alexa Fluor单克隆标记试剂盒（详见表2）
图1. Alexa Fluor系列染料的发射光谱
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表1. 可选择的Alexa Fluor染料
Alexa Fluor 染料 Abs/Em * 光谱类似染料 注 释
Alexa Fluor 350 346/442 AMCA Alexa Fluor 350染料比AMCA 或AMCA-X更易溶于水并产生蛋白耦联，比来自于非磺酸盐类似物（nonsulfonated analog）的染料具有更强的荧光。此外，它的蓝移光谱能与绿色荧光基团的荧光光谱更好的分离。
Alexa Fluor 405 402/421 Pacific Blue dye, Cascade Blue dye Alexa Fluor 405染料是400–410 nm 激发光源的{zj0}荧光基团，包括蓝色二极管激光器的405 nm谱线。
Alexa Fluor 488 495/519 Fluorescein,Oregon Green 488 dye, Rhodamine Green dye, Cy2 dye Alexa Fluor 488蛋白耦联物在荧光强度和光稳定性方面都远超过荧光素，Cy2，和其他的绿色荧光。 与荧光素不同，Alexa Fluor 488染料在pH 4到10间对pH不敏感。
Alexa Fluor 555 555/565 Tetramethylrhodamine, Cy3 dye Alexa Fluor 555耦联物要胜过四甲基罗丹明（tetramethyl rhodamine TRITC和TAMRA）耦联物和Cy3.
Alexa Fluor 568 578/603 Lissamine rhodamine B dye, Rhodamine Red dye Alexa Fluor 568耦联物比Lissamine rhodamine B和Rhodamine Red-X耦联物具有更强的亮度并且能在Ar–Kr激光器的568 nm谱线的下被激发。
Alexa Fluor 594 590/617 Texas Red dye,Cy3.5 dye Alexa Fluor 594耦联物具有极强的光稳定性，比Texas Red耦联物荧光更强，并且可以在橙色He–Ne激光器的594 nm谱线下有效激发。
Alexa Fluor 647 650/668 Cy5 dye,allophycocyanin (APC) Alexa Fluor 647的二抗耦联物的总体荧光要显著高于其他公司提供的Cy5耦联物的总的荧光（图3）。此外，不同于Cy5染料，当Alexa Fluor 647染料与多数蛋白、寡核苷酸、或核酸耦联，它在光吸收或荧光光谱方面几乎没有改变，因此在同等标记程度下会产生更强的荧光。
Alexa Fluor 660 663/690 Cy5.5 dye, APC Alexa Fluor 660染料展示较好的与橙色荧光的光谱分离，包括Alexa Fluor 555染料和藻红蛋白（phycoerythrin PE）。这使得它成为在多色应用时的一个主要的选择。 Alexa Fluor 660染料在分别为He–Ne激光器的633 nm和氪离子激光器的647 nm谱线下被有效激发。
Alexa Fluor 680 679/702 NA Alexa Fluor 680染料高度推荐用于使用LI-COR Odyssey 进行的“In-Cell” Westerns.
Alexa Fluor 750 749/775 Cy7 dye Alexa Fluor 750染料是可以提供的Alexa Fluor染料中波长最长的染料。
* 荧光{zd0}吸收和荧光{zd0}发射，单位 nm. NA = 类似光谱的染料没有提供
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表2- Alexa Fluor染料标记指南
AlexaFluor标记试剂盒 样品要求 标记次数/每个试剂盒 共价结合标记 全部时间 使 用 应 用
Zenon IgG标记试剂盒 ◆ ≤1 μg 的IgG 抗体
◆ 与诸如BSA等稳定蛋白兼容 50次 否 10分钟 ◆ 非常快速标记少量抗体
◆ 同种型特异标记 FC
ICC
IHC ?
ELISA
蛋白标记试剂盒 ◆ 1 mg 的IgG抗体
◆ 在标记前去除稳定蛋白如BSA 3次 是 2小时(30 分钟*) ◆ Alexa Fluor染料共价结合到1 mg纯化抗体上
◆IgG抗体{zj0} ，MW ~150 kD
◆能标记多克隆抗体和单克隆抗体；与单克隆抗体标记剂盒相区别的是全部可用来标记IgG的总量。 FC
ICC
IHC
ELISA
Western
单克隆抗体标记试剂盒 ◆ 100 μg的IgG抗体
◆在标记前去除稳定蛋白如BSA 5次 是 1.5小时(15分钟*) ◆ 染料共价结合到100μg纯化的抗体上
◆ IgG抗体{zj0}, MW ~150 kD
◆能标记多克隆抗体和单克隆抗体；与蛋白标记试剂盒相区别是全部可用来标记的IgG的总量。 FC
ICC
IHC
ELISA
Western
* 典型的实际操作时间。. ?有限使用，推荐用于要求相对短的孵育时间（<2小时，当使用多个抗体时）。FC =流式细胞仪; ICC =免疫细胞化学; IHC =免疫组织化学; ELISA =酶联免疫吸附分析; Western = Western印记杂交

使用Zenon抗体标记技术――在十分钟内进行免疫标记
Zenon免疫标记技术提供了一种简单的、通用的、真正独有的标记IgG抗体的方法，标记采用Molecular Probes的{dj0}染料、半抗原和酶，甚至可以用于很少量（亚微克级）的初始材料的标记。不同寻常的Zenon技术利用了抗体结合反应的免疫选择性，形成由完整的一抗IgG抗体与针对它的Fc部分被荧光、半抗原或者酶标记的Fab片段组成的复合体。每个Zenon抗体标记试剂盒提供一个同种型特异标记（isotype-specific labeled）的Fab片段，此外还有用来准备定量标记一抗IgG的封闭试剂。 由于不需要标记前或标记后的纯化步骤, 进行这种标记的一抗可以与共价标记的一抗以相同的方式快速进行细胞染色或其它的染色，花费仅仅十分钟的时间！Zenon试剂盒包含用来标记鼠IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、兔IgG、人IgG、和山羊IgG抗体的最明亮和{zshy}的AlexaFluor染料、其它荧光基团、半抗原或者酶等关键试剂。使用Zenon抗体标技术，在实验中你可以自由的选择不同的染料和抗体组合以发现{zj0}的搭配来进行多色流式细胞仪和成像实验。我们也提供采用酪胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification）改进了的Zenon试剂盒，以适于增强敏感度的要求。（图2）可以访问下面的网址以了解更多的有关Zenon抗体标记试剂盒产品的细节和全部产品（）

制备共价Alexa Fluor抗体耦联物
Molecular Probes拥有多年的蛋白标记经验, Alexa Fluor蛋白标记试剂盒(1 mg的蛋白样品)或Alexa Fluor单克隆标记试剂盒(100 μg的蛋白样品)，都含有预先准备好的进行氨基反应的Alexa Fluor染料以及用来纯化抗体产品的试剂和材料(表3)。这些蛋白标记试剂盒利用了高效和简单的琥珀酰酯(NHS)化学反应，选择性连接一个Alexa Fluor染料到邻近蛋白的氨基基团（包括赖氨酸侧链和氨基端）上。Alexa Fluor琥珀酰酯是用来进行胺修饰的极好的试剂，因为它们与蛋白形成的共价结合就如同氨基酸间形成的肽键一样稳固。Alexa Fluor琥珀酰酯也可单独提供（表3）以便你能优化你的标记方案，制备用于你研究中的理想的Alexa Fluor耦联物。

表3. 可选择的Alexa Fluor 琥珀酰（NHS）酯和蛋白标记试剂盒
Alexa Fluor 染料 琥珀酰（NHS）酯* 蛋白标记试剂盒? 单抗标记试剂盒?
Alexa Fluor 350 A10168 A10170 A20180
Alexa Fluor 488 A20000
A20100
A30005 + A10235 A20181
Alexa Fluor 555 A20009, A20109 A20174 A20187
Alexa Fluor 568 A20003, A20103 A10238 A20184
Alexa Fluor 594 A20004, A20104 A10239 A20185
Alexa Fluor 647 A20006, A20106 A20173 A20186
Alexa Fluor 660 A20007, A20107 A20171 Inquire
Alexa Fluor 680 A20008, A20108 A20172 Inquire
除了Alexa Fluor 350染料仅以5 mg为包装单位和Alexa Fluor 488 四氟苯酯仅以1 mg为包装单位外，Alexa Fluor 琥珀酰酯以1 mg或 5 mg为包装单位。 + 胺反应四氟苯酯(TFP)酯如同琥珀酰酯可以在染料与目的复合物间产生与氨键同样强的键，但是它更不容易在结合反应中自发水解。Inquire = 请发送产品质询到.
*请登录Invitrogen中文网站查询产品报价

每个Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒和Alexa Fluor 488单克隆标记试剂盒含有替代琥珀酰酯的氨基反应（amine-reactive）Alexa Fluor 488四氟苯酯（tetrafluorophenly TFP）。这种四氟苯酯像琥珀酰酯一样可以产生在染料与抗体间产生与胺键同样强的键，但是四氟苯酯更不容易在结合反应中自发水解。Alexa Fluor 488四氟苯酯也可以单独提供（表3）。
通过标记的二抗增强信号
如果所制备的标记一抗是不实用的，或者无法提供足够的灵敏度，那就需要高质量的二抗来解决问题。尽管来自于一抗和二抗的非特异性结合可以提高背景水平，选择一个较好的标记了的二抗，通常可以通过显著性的信号扩增来克服升高了的荧光背景。当然，不是每一个商业上可以提供的二抗都是xx被纯化或优化标记的(图3)。Molecular Probes提供了在任何地方均可获得的可以进行{zd0}选择的荧光二抗。（全部目录详见在线手册的第7章，网址是 ）。
图3. Molecular Probes的Alexa Fluor 647山羊抗鼠IgG 抗体与可购买到的其它公司提供的Cy5 山羊抗鼠IgG抗体亮度的比较
这些包括具有强烈荧光的Alexa Fluor抗体耦合物，在各个光谱都胜过大多数常规使用的荧光二抗。在制备每个二抗耦合物时，我们采用了质量{zg}的蛋白，然后优化标记，以形成最亮的的耦合物，{zh1}使用细胞样品进行严格的测试，以确保低非特异性结合和高特异性染色。
Alexa Fluor二抗正快速成为所有基于荧光免疫测定的{sx}的二级试剂。在我们新的Image-iT 试剂盒中还将包含几个AlexaFluor抗体耦合物—－每个Image-iT试剂盒都含一个明亮的并且光稳定的Alexa Fluor耦合物和所有用来优化固定细胞和组织成像的试剂。
通过酪胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification）促使信号增强
当实验样品的靶点不是很丰富的时候，通过二抗的信号扩增是不够的。对于此种情况，我们已经开发了酪胺信号放大技术(TSA)试剂盒(表4)，它利用了超亮度的Alexa Fluor染料以达到最终的高清晰度信号扩增。TSA 技术—有时也称作CARD（catalyzed reporter deposition）—是一种利用了辣根过氧化物酶(HRP)的催化活性在靶蛋白或核酸序列上产生高密度原位标记的酶介导检测方法 (图4)。 据报道，与常规的亲合素-生物素酰化酶复合体（ABC）方法相比，TSA能将信号扩大100倍。在目前可提供的24种Alexa Fluor TSA试剂盒中(表4)，每个耦合于二抗或链霉亲合素上的HRPxx大量的Alexa Fluor tyramide，它可以产生短寿命的，并能与反应位点临近的亲核残基发生强烈反应的tyramide基团，进而产生一个扩散程度最小的放大荧光信号。使用AlexaFluor TSA试剂盒能够在荧光原位杂交(FISH)、免疫组化、神经解剖学追踪实验、流式细胞仪测定、酶联免疫吸附分析(ELISAs)、微阵列和其它应用中完成超灵敏的测定。

对那些既想要容易地使用Zenon 技术提供的HRP，又想用TSA提供的信号扩增技术标记鼠一抗IgG1的研究人员，我们已经开发了两个使用TSA技术改进的Zenon鼠IgG1标记试剂盒－—其中一个含有绿色荧光 Alexa Fluor 488 tyramide，另一个含有桔红色荧光Alexa Fluor 568 tyramide。这些试剂盒提供了来自于Zenon辣根过氧化物酶鼠IgG1标记试剂盒以及相应的Alexa Fluor TSA试剂盒所必需的试剂，一起的还有详细的进行Zenon复合体形成及tyramide标记的操作流程。更重要的，这种Zenon和TSA技术的结合不受鼠IgG1同种型和Alexa Fluor 488 与 Alexa Fluor 568 tyramides的限制。由于可以得到鼠IgG1、鼠IgG2a、鼠IgG2b、兔IgG和人IgG Zenon辣根过氧化物酶抗体标记试剂盒，任何具有这些同种型（isotypes）的一抗都能方便地和定量地用HRP来标记，以代替在任何含有这些耦联物的TSA试剂盒中由HRP耦联的二抗。