火鸡蓝冠病的研究进展

　　蓝冠病(Bluecomb)又称冠状病毒性肠炎(Coronaviral enteritis)、泥淖热(Mud fever)、传播性肠炎(Transmissible enteritis)或传染性肠炎(Infectious enteritis)，是一种对各种年龄火鸡均可感染的急性、高度传染性疾病。临床特征主要表现为食欲不振、不断鸣叫、体重减轻、精神沉郁和腹泻。

　　1 发病历史

　　1951年美国的Peterson等首次报道了火鸡的一种新病，并称之为“泥淖热”，此病和7年前发生于华盛顿州的一种雏火鸡病具有共同的特征，后因其具有特征性的蓝冠变化，改称蓝冠病。1951年，美国明尼苏达州的雏火鸡暴发了蓝冠病，表现为严重发病和死亡，此后的20多年中，火鸡蓝冠病在该州大规模流行，造成了巨大的经济损失，仅1966年蓝冠病导致的火鸡死亡数就占该州全部火鸡死亡数的23%，损失达50.0万美元以上。在其他地区，蓝冠病也同样是引起火鸡死亡的一个重要原因。20世纪90年代初期，在印地安纳州、北卡罗来州等地也相继暴发了此病，损失巨大，其中1994年，在DuBois县由蓝冠病引起火鸡的死亡、发育迟缓等造成的损失和用于xx控制的费用就高达192.6万美元；此外，在南卡罗来、佐治亚、维吉尼亚、纽约州以及其他州也有此病的发生。近年来，蓝冠病在美国的发生又有所上升。

　　1961年Ferguson报道，在加拿大安略湖发生蓝冠病，此后，魁北克也暴发了该病。1985年Dea等在魁北克分离到3株火鸡蓝冠病病毒。澳大利亚也有此病的报道，但欧洲不曾见有关报道；迄今国内还未见有关火鸡蓝冠病的研究和报道。

　　2 病原

　　对于蓝冠病病原的研究已持续了20多年。此前认为弧菌、呼肠孤病毒、肠道病毒和乳多空病毒都有可能是蓝冠病的病原，但用上述病原均未复制出蓝冠病。1971年，Adams等采用鸡胚和火鸡胚增殖病毒，首次人工复制出蓝冠病病毒。直到1973年，才确定火鸡冠状病毒(TCV)是蓝冠病的病原。

　　2.1 病毒的分类及地位

　　冠状病毒属于RNA病毒科，依据血清学试验和基因测序结果，将冠状病毒分为3个不同的抗原群。第1群是食肉动物、偶蹄动物和灵长类的冠状病毒，包括猫传染性腹膜炎冠状病毒(FCV)、犬冠状病毒(CCV)(猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、人冠状病毒(HCV229E)。第2群是偶蹄动物、单蹄动物、啮齿动物和禽类的冠状病毒，包括马冠状病毒(ECV)、牛冠状病毒(BCV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、大鼠冠状病毒(RCV)、大鼠涎泪腺炎冠状病毒(SDAV)。第3群是在禽类中发现的，包括鸡传染性xxxx病毒(IBV)和TCV，新分离的人SARS冠状病毒在抗原性上与上述3群差别较大，有人提议将其单列为第4群冠状病毒。

　　以前通过病毒中和试验，血凝抑制试验以及基因测序，认为TCV与BCV同源性很高，所以把TCV归为第2群。后来更多的研究xx了这种结论。1997年Guy等用免疫荧光试验显示，TCV和IBV的单抗不能与TGEV或BCV发生反应，而IBV的多抗和抗IBVM蛋白的单抗能够与TCV反应，但TCV的多抗不能与IBV发生反应，说明TCV和IBV的抗原更为接近，但也存在差异。1999年Breslin等对TCV N基因全序列(约2.6kb)3′端非编码区和M基因的部分序列测定，并与IBV和哺乳动物冠状病毒进行了比较分析。发现TCV和IBV的M、N基因的同源性高于90%，而与哺乳动物的冠状病毒的同源性低于30%。TCV和IBV的3′端非编码区同源性高于78%，与哺乳动物的冠状病毒的同源性低于30%。1999年Stephensen等测定了TCV一段非常保守的聚合酶基。因并与IBV和9种哺乳动物的冠状病毒进行了比较，同样证实TCV与IBV更为接近。

　　2.2 宿主范围

　　TCV和其他冠状病毒一样，有限定的宿主范围，曾认为火鸡是TCV的{wy}宿主，研究表明，雏鸡、野鸡、海鸥、鹌鹑均不易感染TCV。但1999年Guy等的研究表明，雏鸡能感染TCV，1日龄SPF雏鸡经口感染TCV，虽然没有明显的临床症状，但在接种后2-8d，证明有血清学变化，并在肠道和腔上囊中发现了TCV的病毒抗原。

　　2.3 分离培养

　　1989年Dea等用人直肠腺癌传代细胞系HRT-18能够使TCV连续传代。1994年Rodgers等将TCV接种鸵鸟胚成纤维细胞可导致细胞病变。然而TCV在这些器官和细胞培养物中不能增殖，但能存活120h之久。1991年Dea等报道TCV能在火鸡胚或鸡胚中生长增殖，将其经羊膜腔接种于15日龄以上的火鸡胚或16日龄以上的鸡胚，均能生长繁殖；接种23-24日龄火鸡胚，其肠道、卵黄和腔上囊均有病毒存在，且孵出的雏火鸡出现蓝冠病症状和死亡。将TCV Minnesota毒株经火鸡胚传至100代后，仍保留对雏火鸡的致病性。

　　2.4 病毒形态及理化特性

　　TCV直径约为135 nm(50-150nm)，囊膜上有日冕状纤突，在蔗糖中的浮密度为1.16-1.24g/mL。该病毒在4℃下经氯仿处理10min可使之灭活，在22℃pH3条件下处理30min不能降低其感染性，50℃处理1 h或在1mol/L硫酸镁存在的情况下均能存活。Minnesota、Quebec毒株均能凝集兔和豚鼠的红细胞，但不能凝集牛、马、绵羊、小鼠、猴、鹅、鸡的红细胞。

　　2.5 结构蛋白及其功能

　　冠状病毒一般含M、N和S 3种主要结构蛋白，而TCV还含第4种结构蛋白——He蛋白。

　　2.5.1 M蛋白 是一种跨膜糖蛋白，分子质量大约为20-35ku。M蛋白大部分位于囊膜内，仅有N端糖基化的小部分暴露在双层脂质外面；该蛋白的功能是在病毒装配时将核衣壳连接到囊膜上。抗M蛋白的抗体在补体存在时可中和病毒的感染性。

　　2.5.2 N蛋白 是病毒的核蛋白，分子质量大约方45-60ku。N蛋白基因是冠状病毒3个不同抗原群之间变异{zd0}的，但在同一群的冠状病毒中则高度保守。1999年Breslin等测定了TCV Minnesota、Indiana和NC95毒株的N蛋白基因全序列，其中3个毒株的CDs均为1 230bp，共编码410个氨基酸，其同源性为93.82%。N蛋白是病毒内部的一种蛋白质，其功能主要是包裹核酸，使之易装配于核衣壳中，其上有大量抗原决定簇，能诱导产生抗体，且有很强的免疫原性。

　　2.5.3 S蛋白 是纤突糖蛋白，分子质量大约为90-180ku，与M、N蛋白相比，S蛋白在进化上最为活跃。该蛋白位于病毒最外层，大部分暴露在脂质层外，为构成囊膜突起的主要成分，由S1和S2两种多肽组成。2003年Jackwood等测定了Gh、G1毒株S蛋白基因全序列：Gh株全长3 702bp，其中S1为1 614bp，由538个氨基酸组成；S2长度为2 001bp，由667个氨基酸组成。G1株全长3 711 bp，S1为1 623bp，由541个氨基酸组成；S2为2 001 bp，由667个氨基酸组成，两毒株S蛋白基因之间的同源性高达96.00%。S蛋白能与宿主细胞受体结合，并穿透宿主靶细胞，具有诱导产生中和抗体和细胞介导免疫等功能。

　　2.5.4 He蛋白 又称E3蛋白，是囊膜上第3种糖蛋白，分子质量为120-140ku，有血凝活性，能凝集红细胞，还具有乙酰脂酶活性。

　　3 诊断

　　火鸡蓝冠病主要表现为食欲不振，水样腹泻，羽毛蓬乱，体重降低，发育迟缓甚至停止生长。7-28日龄雏火鸡最易发病，该病发病率高，接近{bfb}；死亡率也较高，雏火鸡可达50%-{bfb}，6-8周龄的火鸡约为50%。蓝冠病的病变主要集中在肠道；可引起肠黏膜损伤，包括肠绒毛变短、微绒毛脱落、上皮细胞脱落及空肠、回肠、盲肠出血等。

　　3.1 常用的诊断方法

　　取发病火鸡的肠道匀浆上清，经口感染1-7日龄雏火鸡，复制该病。同时采集肠道、腔上囊病料制成匀浆，负染后直接电镜检查，进行实验室快速检测，然而细胞碎片的干扰常常难以识别，需经过聚乙二醇沉淀后则易辨认出冠状病毒。

　　3.2 荧光抗体试验

　　该方法是目前检测火鸡感染TCV和鉴定TCV粒子最重要的血清学方法。直接荧光抗体法可用于检测感染TCV后1-28d的自然病例和人，工感染火鸡胚或雏火鸡的肠上皮中的TCV；间接荧光抗体法可用于检测感染后9-160d的血清抗体，同时也可用于TCV的检测。然而荧光抗体试验需要熟练的操作技能和昂贵的设备，在临床上难以实施。

　　3.3 双夹心ELISA法

　　1989年Dea等建立了该方法，此法比电镜检测更敏感，可以一次检测大量样品。用于检测的抗原需要经过纯化：病毒经火鸡胚或鸡胚增殖后，做蔗糖密度梯度离心，{zh1}超速离心获得纯化抗原。但是，这种抗原仍含有很多杂蛋白，超速离心也很容易破坏冠状病毒粒子。2002年Loa等，利用排阻色谱法纯化抗原取得了较好的效果，2004年抗原纯化取得了突破性进展，Loa等用大肠埃希氏菌成功地表达了TCV N蛋白，并通过提纯获得大量高纯度的病毒抗原，用此抗原进行抗体捕获ELISA诊断蓝冠病具有非常高的特异性。

　　3.4 RT-PCR法

　　为检测TCV的{zx1}方法。Breslin等以病毒分离作参考对病毒分离、荧光抗体试验、间接ELISA和RT-PCR方法的敏感性进行了比较，结果RT-PCR方法的敏感性和特异性分别为93%和92%；而荧光抗体试验和间接ELISA方法的敏感性分别为69%和61%，特异性均为96%。可见，RT-PCR比常规方法具有更高的特异性和敏感性。

　　4 防治

　　火鸡群一旦感染TCV，很难xx，而且将频繁发生。目前xx蓝冠病没有特异性的xx。美国对于暴发蓝冠病的火鸡场，通常采取扑杀火鸡，对禽舍及其周围环境彻底xx，重新引进火鸡前空舍一定时间等措施控制该病。目前的研究认为，体液免疫在抗TCV感染时发挥主要作用，TCV感染产生的肠道黏膜IgA抗体，能抵抗该病毒再次感染，康复火鸡具有坚强的xxx，很少能再次感染，以上结果提示，用TCV疫苗预防蓝冠病具有可行性，快速诊断以及血清学监测是目前预防该病的重要手段，此外做好火鸡场的综合性卫生防疫工作也有助于疾病的防制。

　　近几年来，火鸡养殖业在我国逐渐升温，部分地区已出现比较密集的火鸡饲养带。笔者在对火鸡进行临床检测时发现，我国某些火鸡场存在TCV感染的疑似病例，应引起火鸡饲养行业的高度重视。

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