传统xxx鉴定的主要方法有基源鉴定、显微鉴定、理化鉴定、生物鉴定，然而这些鉴定特征几乎均为生物体的遗传性表现型，不仅受到遗传因素的影响，而且与生物体的生长发育阶段、环境条件、人类活动如引种驯化、加工炮制等有着密切的关系，具有很大的变异性和随意性，难免存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点，因此对鉴定结果的可靠性带来了一定的影响。近年来，随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术已广泛用于药用植物遗传多样性、系统学、分类学研究，并逐渐渗透到xxx的鉴定领域，推动了xxx鉴定研究的发展。DNA分子作为遗传信息的载体，信息含量大，在同种内具有高度的遗传稳定性，且不受外界环境因素和生物发育阶段及器官组织差异的影响，因此用DNA分子特征作为遗传标记进行xxx鉴别具有更为准确可靠，非常适用于近缘种、易混淆品种、珍稀品种等的植物鉴定。目前，用于xxx鉴定的分子标记技术主要有DALP、ISSR、RAPD、PCR-RFLP、DNA测序技术等，本文概述了近年来国内外分子标记技术在xxx鉴定中的发展与应用。
1.直接扩增片断长度多态性(direct amplification 0f length polymorphism，DALP)
   DALP技术是一项新的分子标记技术，是基于 PCR(聚合酶链式反应)技术扩增基因组DNA限制性片段，基因组DNA先用限制性内切酶切割，然后将双链接头连接到DNA片段的末端，接头序列和相邻的限制性位点序列，作为引物结合位点，它是用于检测基因多态性并用扩增产物直接测序的一种新方法。DALP拥有RAPD(随机扩增性多态DNA)信息量大的优点，同时也不需要被分析样品的基因组参考序列。而其引物序列相对RAPD较长(RAPD引物不多于10个碱基)，PCR扩增时使用以相对高的退火温度，这些都使得DALP的结果比RAPD有更高的重复性和稳定性。同时，由于使用以通用引物 M13为核心序列的双引物扩增，得到的DNA条带5′端和3′端的序列不一样，但都含有对应的M13序列，所以可以用充作其核心序列的M13测序引物直接测序，省去了繁琐的克隆步骤，简化了实验流程。 DALP最早用于检测基因组中微小的插入、缺失、变异和微卫星DNA位点，结果得到的7个多态性位点中有6个出现微小的插入或缺失现象，1个含有数量可变的重复序列(微卫星位点)。DALP是共显性标记，能检测出纯合基因型及杂合基因型，提供了完整的遗传信息，技术难度低、耗费小。DALP克服了传统分子鉴定的缺点，共显性数据提高了数据可信度。李永谊等将DALP反应体系用于红景天属药材的分类鉴定和道地性鉴定。王海英等采用 DALP分子标记技术，对产自云南的药用植物丽江山慈菇Iphigenia indica(L.)Kunth的9个居群进行 DNA指纹检测，分析其遗传多样性。王琼等采用 DALP分子标记技术寻找野山人参和栽培人参DNA之间的特异性差异。
2.简单重复序列间多态性(inter-simple sequence repeat，ISSR)技术
    ISSR是由Ziekiewicz等1994年创建的一种类似RAPD的分子标记技术，其引物是根据基因组内某一重复序列设计出一系列特异性引物，包括双核苷酸、三核苷酸和四核苷酸等微卫星片断，与基因组中的微卫星序列(MS)互补，并且具有和基因组重复序列5′端或者3′端退火的寡聚核苷酸锚定序列，长约17～22 bp。这种技术除具有RAPD优点外，比 RAPD技术更具有鲜明的针对性，它利用重复锚定引物扩增SSR(简单重复序列)之间的片断，具有重复性好、稳定性高、多态性丰富等优点。周延清等利用ISSR标记技术对怀庆地黄的8个品种和2个茎尖培养脱毒系进行了遗传多样性分析；曹雅男等用RAPD和ISSR方法分析了4种xx龙胆的亲缘关系及遗传多样性；沈颖等采用ISSR-PCR方法探讨不同种石斛在DNA分子水平上的差异；葛永奇等采用ISSR标记分析银杏群体遗传多样性等。
3随机扩增多态性DNA(random amplified polymor- phic DNA，RAPD 0r arbitrarilyprimed polymerase chain reaction，AP-PCR)
    随机扩增多态性DNA(random amplified poly- morphic DNA，RAPD)，创立于20世纪90年代,是一种以10bp寡聚核苷酸为引物的PCR技术。由于RAPD具有快速、灵敏，不需要知道被检基因组序列且对模板质量要求不高等特点，在药用植物系统学研究上有独到的优势。它能够通过不同引物给出整个基因组的多态性信息，避免了生长环境和发育时期不同的影响，并从DNA水平上对分类群比较分析，确定药用植物种、品种的亲缘关系，绘制系统发育树状图。曹晖等用该方法成功的鉴定了中药材地胆草与白花地胆草混淆品；陈京荔等用此方法对地黄不同品种进行分析；曹雅男等用 RAPD和ISSR方法分析了4种xx龙胆的亲缘关系及遗传多样性；马伯军纠等通过对佛手RAPD反应的优化，分析其遗传多态性，并对3个品种作出了分子水平的鉴定；陈林娇等对溪黄草及其药用近缘种进行了分析；张铭等利用RAPD技术对26种石斛进行了基因组DNA多态性分析并构建了聚类树状图；Cole CT等运用随即扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)的方法对乌头进行类别归属等。目前研究涉及的xxx还有麦冬、金线莲、牛膝、射干、泽泻、当归等。但由于RAPD对DNA模板质量要求较高，药材有不同程度的降解，影响RAPD反应结果，重现性较差，其鉴别标准在不同实验室难以稳定地重复。因此对 RAPD标记的系统学价值，国内外的研究者作出了如下评论：RAPD标记xx适用于种内水平的亲缘关系的研究，也可以用于种间乃至近缘属间亲缘关系的研究，但有一定的局限性。
4.DNA测序法
    DNA测序法是通过测定目的基因片段的核苷酸序列，并比较序列间的差异来确定各类群间有鉴定意义的特异性位点，从而达到鉴定的目的。针对要解决xxx的科属、种间还是种内居群间的差异问题，选择合适的基因片段进行序列测定与分析。 Konodot对半夏和天南星原植物及药材rbcL基因的部分序列进行分析，结果显示其DNA片断分为7个类型，对半夏具有鉴定价值。Fushimi通过分析18S-rRNA基因序列能够鉴别中国产川芎(Ligustic- ttm chuanxiong Hort.)和日本产川芎(Cnidium offici- nale Makino)。章群采用PCR产物直接测序法测定杜仲原植物matK基因序列，分析其序列特征。
    近年来，随着分子生物学技术的发展，植物 DNA序列由于进化速率上的差异而被广泛用于不同分类阶元的系统发育研究。其中核糖体DNA中 ITS(中度重复系列)因其基因片段短，扩增和测序容易而越来越广泛地用于植物分类学的研究。国内外大量研究表明ITS区序列在探讨古老原始的被子植物科内系统发育关系，揭示被子植物的起源与进化过程中又具有非常重要的意义。Yan Luo等运用 ITS序列对毛莨科植物的种系发生进行研究；杨滨等用随机引物扩增多态方法对中药白芷的4种商品类型进行分析，并在此基础上，对其ITS区序列分析；刘春生等运用序列分析对细辛药材基源及分子鉴定进行研究，分析了3个基源的细辛的亲缘关系；蒋继宏等分析了苏皖产大戟属药用有毒植物。
    DNA测序法已在xxx鉴定中有广泛应用，目前涉及到的中药还有丹参、菱属植物、葛根、杜仲、泽泻、花椒、白花蛇舌草、巴戟天、虫草、贝母、黄芪、番红花、石斛、肉桂、藏茵陈、阳春砂等。
5扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)
    AFLP技术是一项新的分子标记技术，是建立在基因组限制性片段基础上的PCR扩增。由于不同物种的基因组DNA大小不同，基因组DNA经限制性内切酶酶切后，产生分子量大小不同的限制性片段。使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板，用含有选择性碱基的引物对模板DNA进行扩增，选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性，只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检出多态性。它结合了RFLP和PCR技术特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR技术的高效性。近年来该技术已广泛应用于遗传图谱构建、中药基因定位、遗传多样性分析、分子标记辅助育种及生物系统分类等方面的研究。罗志勇等采用 AFLP法构建人参、西洋参基因组DNA指纹图谱；虞泓等对石斛属4种植物进行了AFLP分析。 AFLP可在一次单个反应中检测到大量的片段，所以说AFLP技术是一种新的而且有很大功能的DNA指纹技术。但是AFLP技术受到专利保护，应用受到限制，试剂盒价格昂贵；另外，操作中通常要利用同位素标记，对样品DNA质量要求严格等，限制了其在实践中的应用。
6位点特异性鉴别PCR(allele-specific diagnostic PCR)
    位点特异性鉴别PCR是中药材品种鉴别的一种新方法PCR鉴别技术，该方法以PCR反应为基础，通过对xx药材及其伪、混品的某些DNA片段的序列研究，找出xx药材的特异性位点，设计出只扩增xx药材的高度特异性的鉴别引物。当有样品需要鉴定时，提取DNA后，用鉴别引物对样品进行一次PCR，经电泳检测便可达到准确鉴别样品真伪的目的。由于位点鉴别PCR用的是高特异性引物，其反应的复性温度高，一般性污染也不致于影响鉴定结果的准确性，对实验操作的要求也不十分高，因此鉴定技术较易掌握，具有较大的实用价值。蔡金娜等用该方法对蛇床和兰科部分药材等进行分析，探讨不同分布区的蛇床变异与其地理分布的化学成分的相关性。位点特异性PCR技术在中药材鉴定研究中能克服其用分子标记鉴别技术进行药材分子鉴别时存在的成本高，重现性不好，鉴别程序复杂等实际问题，使在xxx鉴别中推广应用DNA分子标记鉴别技术成为可能。
7展望
    以DNA分子标记作为特征进行xxx的鉴定，与经典的xxx鉴定方法相比，具有特异性强、稳定性高、快速、微量，且不受生长发育阶段、器官组织差异、环境条件影响等优势，已在xxx鉴定中展示了良好的应用前景，日益受到中药研究工作者的广泛xx和实际应用。虽然目前xxxDNA分子鉴定方法尚处于资料积累阶段，可以预见，利用DNA分子标记技术，对于推进中药现代化进程，将提供更有效的方法和手段。

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