中国药品生物制品检定所 李湛军
生物检定(bioassay )
一些生化xx质量标准中有生物活性测定 安全性检查 (多组分生化药的原材料来源于人、动物的组织或者体液,或者通过发酵而来.其组分不明确、按照化学药品的质控方式很难控制其质量 ) 多组分生化药注射剂基本技术要求: 涉及到多组分生化药特性的指标应订入质量标准 ,如过敏物质、降压物质、异常毒性等.活性测定也是反映产品质量的重要指标,有时比含量测定更具专属性,建议将活性测定收入标准
生物检定(bioassay )
按生物体分类:体内测定 (in vivo)—整体动物 体外测定(in vitro)—离体器官、组织,微生物、酶和细胞 (原代细胞、传代细胞)
中国药典2005版二部中的生物检定
用于生物活性测定的生化xx有21品种 (约占我国生化药的10% )安全性检查—很多生化xx(无菌、微生物限度、热原、xx内毒素、异常毒性、降压物质、过敏等)
生物检定针对的品种—多组分生化药
对无适当理化方法检定、常规化学测定方法较难建立,不能控制其质量的药品生物检定是反映产品质量的重要指标,具有专属性当前英国、美国及中国药典都有收载
生物检定的重要作用
新药研发初始阶段(体外测定筛选有效成分、整体动物试验确认药效)生产阶段:评价产品批与批之间稳定性和 一致性生产工艺验证 (生物检定可监测不曾预料、不易发现的 构象变化,它是所有变化的综合效应)
生产工艺验证的品种
DNA重组人生长xx、人胰岛素、人胰高血糖素 ,降钙素等常规检定已用理化测定 (HPLC) 药典(BP、ChP)规定:在研发阶段,生产过程中的产品必须用体内生物测定方法测定其生物效价,直到生产稳定为止
活性测定分类
活性测定—定量:质量标准中生物效价 测定(HCG、HMG、肝素)半定量 —定性
活性测定——半定量
半定量——当理化测定占主导地位,生物效价测定降为辅助作用,只用于活性检查,设定限值,采用半定量方法,不需xx的生物统计,尽可能减少实验动物用量 如xx二型糖尿病新药重组人胰高血糖素类多肽-1(7-36)质量标准中采用半定量方法(限值为小鼠血糖降低应大于20%)进行活性检查
活性测定——定性
定性(鉴别 Identity)对质量控制能用理化测定的产品,生物测定从主导地位的定量测定降为次要的鉴别项的定性测定,只用较少的动物例如USP29版:缩宫素(oxytocin)子宫收缩法用于鉴别;升压素(Vasopressin)大鼠血压升高法用于鉴别,效价测定均采用HPLC法ChP2005版二部缩宫素仍用定量生物测定法
生化药标准中的体内生物检定(1)
9th册
活性检查
家兔升高白细胞法
灵杆菌多糖
9th册
活性检查
家兔升高白细胞法
小牛脾提取物
14th册地标升国标
效价测定
大鼠肾上腺内维C降低
促皮质素
ChP 2005
效价测定
大鼠血压升高法
垂体后叶
ChP 2005
效价测定
雌幼小鼠子宫增重法
HCG绒促性素
ChP 2005
鉴别效价测定
FSH大鼠卵巢增重法 LH大鼠精囊增重法
HMG尿促性素
收载标准
应用
生测方法
生化药名
生化药标准中的体内生物检定(2)
ChP 2005
效价测定
小鼠网织红细胞计数
人红细胞生成素
BP2007
工艺验证
兔血糖升高法
人胰高血糖素
USP29
鉴别
大鼠血压升高法
升压素
BP2007
效价测定
雌幼大鼠卵巢增重法
孕马血清促性腺xx
ChP 2005
工艺验证
大鼠血钙法
降钙素
ChP 2005
工艺验证
去垂体大鼠体重法和胫骨法
rhGH重组人生长xx
收载标准
应用
生测方法
生化药名
生化药标准中的体外生物检定(1)离体动物器官、细胞培养、生化酶促反应、免疫学活性等测定法
16th册地标升国标
检查免疫原性
补体结合法
甘露聚糖肽
ChP 2005
效价测定
家兔血,兔猪血浆凝固法
硫酸鱼精蛋白
BP2005
效价测定
酶促反应的分光光度法
低分子肝素
ChP 2005
效价测定
家兔血,兔、猪血浆凝固法
肝素
ChP 2005USP29
效价测定鉴别
大鼠子宫收缩法
缩宫素
收载标准
应用
生测方法
生化药名
生化药标准中的体外生物检定(2)离体动物器官、细胞培养、生化酶促反应、免疫学活性等测定法
9th册
活性检查
SMMC-7721肝癌细胞增殖MTT比色法
牛胎肝提取物
9th册
活性检查
SMMC-7721肝癌细胞增殖MTT比色法
促肝细胞生长素
16th册
活性检查
小鼠脾细胞黏附率法
抗乙肝免疫核糖核酸
16th册
活性检查
小鼠脾细胞黏附率法
抗肿瘤免疫核糖核酸
16th册
活性检查
脱E受体法
转移因子
16th册地标升国标
活性检查
脱E受体法
胸腺肽
收载标准
应用
生测方法
生化药名
基因重组技术产品体外生物检定多采用相对快速重复性好的细胞培养测定法,收载 ChP 2005
效价测定
促进细胞生长
3T3细胞/MTT染色法
碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)
效价测定
抑制细胞生长
L929细胞/结晶紫染色法
肿瘤坏死因子 (TNF)
效价测定
促进细胞生长
CTLL-2细胞/MTT比色法
白细胞介素-2 (IL-2)
效价测定
促进细胞生长
3T3细胞/MTT比色法
表皮生长因子(EGF)
效价测定
促进细胞生长
TF-1细胞/MTT比色法
粒细胞-巨嗜细胞集落刺激因子(GM-CSF)
效价测定
促进细胞生长
NFS-60细胞/MTT比色法
粒细胞集落刺激因子(G-CSF)
效价测定
间接保护细胞
Wish细胞病变抑制/结晶紫染色法
干扰素(IFN)
应用
原理
生测方法
生化药名
实验设计与生物统计
生物测定(无论体内、体外 )的实验误差比理化测定要大控制实验误差尤为重要 试验控制(良好实验操作、试验材料一致性) 合理的实验设计 运用生物统计
例如肝素含片质量标准 (9th册地标升国标)
内为低分子肝素:LMWH,对FXa效价测定采用体外酶促反应的分光光度法 实验设计为标准曲线法 对其相关系数(r)和每一浓度重复次数均未作要求 本实验室增加要求r >0.98和每一浓度至少重复2次对同一批号肝素含片产品测定其抗FXa效价,结果误差仍大,重现性差,波动大,缺乏可比性
改为量反应平行线原理的4·4实验设计并结合生物统计
要求实验可靠性测验通过:直线回归 P<0.01,偏离平行、二次曲线和反向二次曲线P>0.05 P结果较平稳,误差小,重现性好 肝素含片内LMWH不是化学纯品,是一定分子量范围内的多相性成分的分布,其相对分子量、糖链长度、硫酸化数目和位置、结构的不均一性对显色反应的分光光度法均有一定误差
正确的实验设计并运用生物统计提高实验的准确度和精密度
标准曲线法与量反应平行线4·4法测定同一批肝素含片产品抗FXa效价比较
生物检定进展
科技发展,一些生化药已由现代生物技术 (DNA重组、生物合成等 )获得检测技术、结构分析水平的提高产品纯度 生产工艺的成熟、完善,产品达到高纯生物测定 繁琐、实验周期长、准确度差、误差大、耗费大量人力、物力随着对动物保护、对实验动物减少、替代、优化(3R)的呼声越来越高,生物测定已不适应现代科学技术的发展
发展趋势
减少实验动物用量、降低实验费用缩短实验周期,提高实验准确度、精密度和稳定性检测方法的in vitro代替in vivo简单代替繁琐生物测定正从主导地位的定量测定降为辅助作用的半定量、定性测定,直至被取代
胰岛素(动物胰腺提取)生物检定
USP29版胰岛素生物鉴别试验( Bioidentity test) 半定量的8只家兔血糖法(SH、SL,TH、TL组,每组2只),生物效价不得低于15 USP U/mg定量的生物效价测定需用24只家兔血糖法( SH、SL,TH、TL组,每组6只)定量法用于胰岛素标准品标定、新制剂稳定性的考察、胰岛素类似物特异性活性的测定,而不用于常规检定BP2007版胰岛素采用HPLC法ChP2005版二部,动物胰腺提取的胰岛素定量生物测定
中国药典2010年版二部生化药品专业科研项目
1、药品中氨基酸分析方法的研究(归纳分类).(中检所负责)2、蛋白质含量测定方法的规范化研究,增订附录.(上海所负责)3、人工肠液和胃液中所用酶试剂的标准化研究.(中检所和北京所负责)4、缩宫素、降钙素等品种用HPLC法替代生物测定法的研究.(各品种起草单位).5、等电聚焦电泳法的规范化研究,增订附录(中检所负责)6、体外生物活性测定法标准化研究.(中检所负责)7、多合成肽(8、14、28、3、4、9肽)的相关物、不相关物的分析.(中 检所负责)8、硫酸软骨素、香菇多糖、低分子肝素等多糖类xx的分子量及分布的标准物质的研究.(中检所)9、多烯酸乙酯的相关物、不相关物的分析.(北京所)10、氨基酸原料药中其他氨基酸检查方法的考察.(河南所牵头,中检所复核,各品种起草单位参加)
中国药典2010年版二部生化药品专业科研项目
11、降压物质(组胺、类组胺)质谱检测与动物实验相关性的研究.(中检所负责,上海所、广州所、天津所参与)12、应用PCR对人源性药品原材料残留病毒核酸的研究.(中山大学负责)13、生化药注射剂、滴眼剂的可见异物检查研究.(北京所牵头,各品种起草单位参加)14、生化药品过敏原的研究.(中检所负责)15、辅酶A HPLC法与效价测定法的相关验证.(河南所负责)16、磷测定方法的方法学研究.(上海所负责)17、多酶片的质量标准提高.(陕西所负责)18、复方氨基酸注射液等输液中铝元素考察及检查方法的建立.(辽宁所牵头)19、修订分子排阻色谱法中生物大分子聚合物分子量与分子量分布的测定法(增订普适校正法和宽分布标样法).(中检所)
在本实验室已用理化测定代替生物测定两种方法间具有良好相关性(P﹤0.01)的品种
BP2007
分光光度法
血浆凝固法或家兔全血凝固法
低分子肝素
ChP2005BP2007
HPLC
大鼠血钙法
降钙素
ChP2005BP2007
HPLC
小鼠或家兔血糖法
重组人胰岛素
ChP2005BP2007
HPLC
去脑垂体大鼠的体重法和胫骨法
rhGH 重组人生长xx
收载质量标准
理化测定方法
生物测定方法
生化药名
在本实验室已用理化测定代替生物测定两种方法间具有良好相关性(P﹤0.01)的品种
企业标准
HPLC
幼大鼠精囊增重法
重组黄体生成素(rLH)
企业标准
HPLC
幼大鼠卵巢增重法
重组卵泡刺xx(rFSH)
企业标准
HPLC
幼小鼠子宫增重法
重组绒促性素(rHCG)
企业标准
分光光度法
大鼠血脂xx率法
伟素 (Sulodexide)
收载标准
理化测定方法
生物测定方法
生化药名
发展方向
取代 在今后药品质量标准中生物测定逐渐被先进的理化方法、或能保证临床用药安全有效的其它方法所取代,或只存在于生产研究阶段WHO国际药典及药品专家委员会第42次专家会议 (2007年10月 )讨论对于胰岛素、缩宫素等由原来生物测定转化为理化测定的提议
安全性检查(safety test)
一般原则:注射液为肌内注射:异常毒性、过敏反应物质等检查项.原料和工艺易污染热原且用量较大者应考虑设热原检查项注射液为静脉注射 必需设异常毒性、热原(xx内毒素) 、过敏反应物质检查、降压反应物质检查、溶血与凝聚检查等所有安全性检查项多组分生化药注射剂基本技术要求 : 由于原材料为生物来源,成品中含有各种生化物质,为保证注射给药的安全,一般须进行过敏物质、降压物质、异常毒性等检查
药典会:生化药品注射剂标准提高专项工作生化药名 考虑增订的项目
过敏试验
垂体前叶肾上腺皮质提取物注射液
内毒素、异常毒性、过敏试验、有关物质
垂体后叶注射液
异常毒性、考查高分子物质
脱氧核苷酸钠注射液
过敏试验、热原
xx前列腺素E2溶液
热原、异常毒性、过敏试验
灵孢多糖注射液
分子量分布、热原
聚肌胞注射液
蜂毒毒性试验、过敏试验
蜂毒注射液
高分子物质或过敏试验
薄芝糖肽注射液
内毒素、考查有关物质 xx内毒素或热原、异常毒性
巴曲酶注射液注射用、亮菌甲素注射液
生化药名 考虑增订的项目
分子量与分子量分布、溶血与凝聚、过敏试验、有关物质、内毒素
人参多糖注射液
热原改为xx内毒素.
羟乙基淀粉20氯化钠注射液
注
内毒素
乙酰谷酰胺注射液
热原、过敏试验或高分子物质、含量测定制法、安全性试验
胎盘多肽注射液胎盘脂多糖注射液
过敏试验、异常毒性、考查有关物质
精蛋白锌胰岛素注射液
过敏试验、异常毒性过敏试验、异常毒性
中性胰岛素注射液精蛋白重组人胰岛素注射液
xx内毒素或热原、异常毒性
注射用、亮菌甲素注射液
生化药名 考虑增订的项目
安全性试验
核酪注射液
将热原改为内毒素、 透渗压及抗氧剂的含量测定
复方氨基酸注射液(14AA)
注
内毒素、含量测定改HPLC
五肽胃泌素注射液
异常毒性、过敏试验、有关物质、按EP修订
缩宫素注射液
pH值、内毒素、异常毒性、溶血与凝聚、过敏试验、颜色、有关物质、含量测定
鞣酸加压素注射液
异常毒性、过敏试验、有关物质、pH值
硫酸鱼精蛋白注射液
溶血与凝聚、异常毒性、过敏试验等
粉尘螨注射液
鉴别:磷脂酰胆碱的TLC、检查项:过氧化值,溶血性磷脂
脂肪乳注射液(C14