4.1基因组生物标志物——基因组到生命的桥梁

生物技术领域不断取得的技术突破，将寻找基因组生物标志物的研究带到了一个更高的水平。随着基因测序、芯片技术的发展，以及对基因组结构更为深入的了解，各大公司都展开了激烈竞争，大家都希望建立对葡萄糖、胆固醇、人绒毛膜促性腺xx等物质进行基因水平及表观遗传学特征为基础的检测和诊断，以便更早地发现疾病、对患者进行分类以给予不同类型的xx及筛选出最有可能对xx起反应的患者。{dy}批能够从这一技术进展中获益的人群将是癌症患者。

FDA于2007年2月6日批准了{dy}个在美国上市的基因表达芯片检测产品MammaPrint。它是由位于阿姆斯特丹的Agendia公司推出的一款乳腺癌诊断产品。该产品通过检测70个基因的表达，从而预测乳腺癌患者癌症复发的风险高低。

MammaPrint是一种以Agilent Technologies公司的60bp寡核苷酸为基础的芯片，售价4200美元。Agendia公司的科学主任兼荷兰癌症研究所（NCI）的分子肿瘤学教授René Bernards 指出，它可以帮助医生及患者更好地了解疾病。

Bernards指出，肿瘤转移风险高的患者，其10年存活率为50%；而肿瘤转移风险低的患者，其10年存活率高达96%。对转移风险高的患者辅以化疗和xxxx，可以将这个存活率提高至70%。

据Bernards估计，美国有将近90%的乳腺癌患者正在接受化疗，如果这个比例可以缩少至60%，也就是说，只对肿瘤转移风险高的患者进行化疗，那么国家医疗系统将因此而节省数百万美元。同时，那些并不需要化疗，同时也无法从化疗中获益的患者，也因此可以避开令人难以忍受的副作用。

MammaPrint的出现仅仅标志着这一时代的开端。无论是来自学术界还是公司企业的研究人员，目前都在积极努力，期待能够发现新的基于基因表达和表观遗传学修饰的基因组生物标志物，尤其是与癌症相关的标志。

满足不同需求

按照临床目的，可以将基因组生物标志物分为多种类别，包括疾病检测与分类、xx反应性的预测、xx有效性以及预后判断等。

Christina Coughlin是惠氏肿瘤学部门的一名副主管。她指出，惠氏公司的一些研究小组，采用Affymetrix的U133全基因组芯片技术，对抗药性和药敏性细胞株进行靶向信号蛋白分析，进而鉴别候选生物标志物。之后，公司会采用基因工程小鼠或异体移植小鼠筛选{zj1}临床意义的100或200个生物标志物。

Coughlin补充：“我希望能够筛选真正从临床xx中获益的患者，然后将他们纳入我的xx领域，而排除那些对xx具有抗性、无法从中受益的患者。”

其它生物标志物，比如那些通过MammaPrint的70-基因检测芯片发现的标志，可以帮助医生更好地做出xx决策。与MammaPrint相似的一款产品是Oncotype DX。仅仅通过检测21个基因的表达，它就能预测乳腺癌患者的预后及其对化疗的反应。

Steve Shak是Genomic Health的首席医疗官，他指出，每100名被诊断为无淋巴结转移的乳腺癌（ER＋）的妇女中，仅有4名乳腺癌患者需要并且能够从细胞毒性化疗中获益。Oncotype DX采用定量RT-PCR生成一个介于0至100的“复发值（recurrence score）”，该值代表患者癌症复发可能性的大小（4%~35%）。

Shak认为，Oncotype的特别之处是建立了一种新方法，从而得以对石蜡包埋组织中的RNA进行RT-PCR。Genomic Health公司花了整整两年才建立起这个新型方法，其意义在于，使美国乃至全世界得以对过去三十年临床研究中无法检测的组织进行相关检测。

Shak强调，RNA始终都存在于组织中，但它们很容易被分解为片段。研究人员不断优化条件，终于可以稳定可靠地对组织中的RNA进行定量检测了。

不期而遇的发现

Oncotype DX 和 MammaPrint的成功应用，证明了癌症相关基因位点数据库的价值。接下来的问题是，如何把所有相关的基因进行准确定位和分析呢？Arul Chinnaiyan是密歇根大学医学院（University of Michigan School of Medicine）的病理学和泌尿外科学教授，他与研究生Daniel Rhodes一起，建立了一个可以帮助研究人员解决上述问题的资源系统。该系统的潜在价值是建立者本人也无法料想到的。

Oncomine（可从Compendia Bioscience获得）是一个与癌症相关的基因表达状况在线数据库。该数据库中多达608,000,000个数据，它们涵盖了342项针对40种不同疾病类型所进行的研究资料。

Chinnaiyan指出，建立这个数据库似乎源于现实需要。他解释说，他们自己就需要做许多基因表达分析工作，经常有一些同行问他们所研究的基因是否在某种癌症中异常表达。可以这样说，Chinnaiyan和他的学生之所以建立这个数据库，就是为了能够使那些肿瘤学家和生物学家们借助数据库，自己寻找答案。

但Chinnaiyan很快便发现，Oncomine同时还是一个非常有用的用于高通量寻找癌症相关的基因表达数据的工具，就好比是上网时使用的google一样。

Chinnaiyan的实验室借助Oncomine发现了一些生物标志物，其中包括一个发生于前列腺癌的染色体异位（通常染色体异位发生于非实体瘤）。该染色体异位致使基因TMPRSS2和Ets转录因子基因发生基因融合，其中Ets转录因子可以使Ets具有雄xx反应性，在前列腺癌xx中具有重要意义。

Chinnaiyan指出，前列腺癌基因融合从而成为了一个高度特异性的生物标志物，同时也是非常好的xx靶标，就好像Bcr-Abl基因融合既是慢性髓性白血病的生物标志物，也是其xx靶标一样。

由于这一发现实在出乎意料，因此起初Chinnaiyan一度认为自己弄错了。现在，位于圣地亚哥的Gen-Probe公司已经研制出了对尿液标本进行检测从而进行前列腺癌诊断的试剂，该试剂正是基于上述发现。

表观遗传学生物标志物

并非所有基因组生物标志物都以基因表达水平为基础。研究人员最近越来越意识到，表观遗传学改变——无论是DNA甲基化还是组蛋白修饰——都在个体发育和疾病发生过程中扮演着非常关键的角色。

目前发现的大部分表观遗传学生物标志物都集中于DNA超甲基化。DNA超甲基化是肿瘤形成中最常见的现象，超甲基化可以通过对基因启动子进行甲基化修饰，从而沉默肿瘤抑制因子及肿瘤细胞周期调控基因。

印第安纳大学医学院（Indiana University School of Medicine）细胞生理学教授Kenneth Nephew是研究乳腺癌和卵巢癌生物标志物的表观遗传学相关变化的科学家。他表示，这些表观遗传学变化之所以可以作为一类优秀的疾病生物标志物，有下列三个原因：稳定、常见、可获得信号。此外，这些标志还易于检测。当肿瘤细胞死亡后，其细胞内的DNA便进入血液循环。因此，研究人员致力于找出在血液、尿液、粪便和痰液中检测甲基化DNA的方法，从而更早地诊断疾病。

Art Petronis是一名来自位于多伦多的成瘾性及精神卫生中心（Centre for Addiction and Mental Health）的研究人员。他认为，该检测方法与单核苷酸多态性及基因表达生物标志物检测十分相似，都是基于芯片检测的方法。区别只在于需要采用“嵌合式”芯片进行甲基化检测。

“嵌合式”芯片会覆盖整个基因组（或基因组的绝大部分位点），而不是集中于蛋白质编码区域或多态性DNA位点。Petronis采用了两种芯片来寻找复杂的非孟德尔式遗传疾病的表观遗传学标志：一个是包括12000个CpG岛在内的芯片；另一个是Affymetrix公司的GeneChip Human Tiling 2.0R 芯片系列。该产品密度更大，以35bp长度的探针覆盖了整个人类基因组。芯片系列由七个芯片组成。

Petronis指出另外一个区别是，他们需要富集高密度或低密度甲基胞嘧啶的片段，然后检测这些片段。

进行上述步骤通常主要有两个方法，其一基于甲基化DNA具有不同限制性内切酶敏感性；其二则是采用重亚硫酸盐将甲基胞嘧啶转换为尿嘧啶。

Peter Laird是南加利福尼亚大学（University of Southern California）表观基因组中心的主任。他在寻找结肠直肠癌分类和卵巢癌检测的生物标志物的研究中，采用了两种重亚硫酸盐转换策略。

Larid首先采用的是Illumina的 Infinium检测系统——一种可以对12个不同样本中多达27000个CpG岛进行检测的方法。然后，他又采用更为灵敏的名为MethyLight的技术，从而验证候选标志。MethyLight以Applied Biosystems的TaqMan 定量PCR技术为基础，它具有极高的灵敏度。

Larid 认为，借助MethyLight，他们可以有效检出仅占总体0.1%的DNA。而传统的表达谱、修饰谱技术，如芯片检测，都无法达到这一灵敏度。

西北大学（Northwestern University）副教授Victor Levenson认为，采用重硫酸盐修饰的方法进行研究是表观遗传学领域的一项突破。在那之前，想要鉴定出序列特异性的表观遗传学修饰是非常困难的。

但他同时指出，技术突破也要付出代价。首先，重硫酸盐修饰转变碱基通常会破坏85%到95%的DNA，从而产生潜在的偏差。而以剩余DNA为模板进行PCR则是十分困难的，原因之一在于两条链不再互补；其二在于原本由四类碱基组成的序列变成了只包含三类碱基的序列。

因此，Levenson公司采用基于限制性内切酶的方法寻找生物标志物。此外，Epigenomics公司采用名为差异甲基化杂交（DMH）的方法（如图1）。

Epigenomics公司副总裁Achim Plum认为：“上述芯片的好处在于我们已经知道哪些区域应该重点观察。因此，那些被探针覆盖的片段是我们在自身所具有的认识和经验上通过高度筛选而获得的。”

Plum还谈到，公司已经使用DMH方法进行一项肺癌诊断检测技术的研发工作。他说：“这一项目从生物标志物的发现，到最终的临床验证的完成耗时不到一年。通过检测血液中的生物标志物，可以对肺癌进行检测诊断，灵敏度达到69%，特异性达到91%。”Epigenomics公司还与Abbott Molecular合作，建立了一种结肠直肠癌筛选检测方法，该检测是以血液中的甲基化Septin-9 DNA为生物标志物的。Orion Genomics采取了相似的策略，他们采用的是MethylScope检测法，该方法由冷泉港实验室的Robert Martienssen建立（图2）。

图2 该方法中，首先将基因组DNA剪切成为1kb长度左右的片段，将这些片段分为两个部分，其中一部分用甲基化依赖性酶McrBC消化，按照片段大小对消化产物进行分类，挑选出没有被剪切的片段，然后将两部分片段在由210万个寡核苷酸组成的阵列上进行杂交，该阵列由Nimblegen出品。

Orion的CEO Nathan Lakey说：“如果能够找到具有诊断意义的生物标志物，哪怕只是一个区域的序列也能够为我们提供丰富的信息。实验中，我们发现了一个单个位点的表观遗传学改变，它可以将乳腺癌组织和非肿瘤组织鉴别开来，灵敏度和特异性分别达到90%和96%。”

阵列应用范围

哈佛及麻省理工学院Broad研究所（Broad Institute of Harvard and MIT）的Bradley Bernstein建立了一种组蛋白修饰的全基因组筛选法，从而不再需要采用DNA阵列进行相关研究。

“ChIP-Seq”法是将染色质免疫沉淀和Illumina公司的新一代测序技术相结合的产物，由Solexa推出。ChIP-on-chip法采用全基因组微阵列芯片对ChIP数据进行检测。与此类似，ChIP-Seq法也是在全基因组的视角上对染色质改变进行检测的。Bernstein说：“两种方法的区别在于，ChIP-on-chip法是以不同的荧光强度为基础进行检测，而ChIP-Seq则是对某一基因组片段被检测到的次数进行计数。”

图 ChIP-chip技术流程

他接下来解释说：“ChIP-on-chip的结果输出的是模拟信号，而ChIP-Seq是数字信号输出。”

去年八月，Bernstein与人合作进行了一项研究，采用ChIP-Seq对小鼠胚胎干细胞、神经祖细胞、胚胎成纤维细胞基因组中的组蛋白修饰进行鉴别检测。他说：“所获得数据使我们对细胞的发生过程、目前状态及最终方向有了深入了解。”

发表于2月17日《自然》（Nature）杂志的一项研究，描述了检测甲基化DNA的类似方法，该方法可以检测出单碱基的甲基化DNA，方法名叫BS-Seq。BS-Seq是将Solexa的测序技术和重硫酸盐转变法结合；研究人员利用该方法对拟南芥（Arabidopsis）基因组内所有可能的甲基化位点中约93%的位点进行了鉴别。

一旦美国国立卫生研究院（NIH）投入达1亿9千万美元的表观基因组项目启动，上述研究成果将具有不可估量的价值。

Bernstein也承认DNA甲基化与组蛋白修饰相比，在生物标志物研究中具有更大的价值。这是因为，肿瘤细胞释放DNA进入血液循环后，并不会同时释放完整的染色质，因此，组蛋白标记只能在未受损细胞和组织中进行检测。

他说：“组蛋白和染色质中包含着更为丰富的信息，但是它们也更难测定。”

Stephen Baylin是马里兰州Baltimore市Sidney Kimmel综合性肿瘤中心（Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center）的研究人员，他表示，无论怎样，这些研究都将是通往个性化xx道路上重要的一步。