新型老鼠药配方工艺技术

1：100倍（0.8％）的毒鼠磷毒饵饲养褐家鼠和小家鼠，投饵后24小时观察，死亡率皆达100％，但是由于毒鼠磷的气味较浓，在实际运用于灭鼠时，毒饵易被害鼠察觉而拒食，灭鼠仅29.88％，只及鼠钠盐32.26％，不能达到预期的效果，于是，首先从探求{zd1}有效使用浓度入手，试图以此解决适口性的问题。当浓度降低到0.06％[1：120倍]时，适口性虽然有了明显改善，但仍不够理想。浓度稀释到0.53％[1：150倍]，与0.66仍然相仿，灭鼠效果徘徊在70％左右。浓度再降低时，灭效也逐渐下降。

1、改进配方。

将醇化毒鼠的乙醇，由原来的毒鼠磷重量的15倍减少到6倍（加入2％的保险系数），所减少的9倍于配制毒饵时兑水补足，降低乙醇消耗量60％，保证了原来的灭效。

2、改进投饵方法。

通过用常规浓度（0.53％的毒饵在室内对家鼠进行饲养试验观察，逐步将大田灭鼠投饵量由开始的每洞10克（250-400）减少到1克左右（30-40粒）；每堆投饵量由开始的5-10克（180-360粒）减少到0.5-0.8克（20-30粒），而适当的增中投饵堆数。实践证明，这样并不]影响防效。使每亩平均饵料消耗量由开始的250克减少至150-200克，节省了20-40倍。

通过以上技术改革，使灭鼠投资使用0.05％敌鼠钠盐毒饵降低了53.14％，较开始试用0.08％毒鼠磷降低了41.62％。

二、毒饵配方及工艺流程：

1、配方：原药（80％）：乙醇（95％医用）：水：糖精：饵料=1：3：12—27（视季节而定）：适量：150。

1、工艺流程：

（1）将原药倒入乙醇中密封，充分振荡，使其溶于乙醇中，搁置3小时，每小时充分摇荡1次，促其醇化；

（2）配制前，将饵料炒热至烫手，以不能用手紧握为度。但勿炒糊，以免影响其适口性。这样做的作用

三：一是使毒液尽信息量能渗透入饵料内，不至过多的外壳上。二是增加毒饵的诱鼠力；三是在大田播种前使用时，毒饵不至发芽，造成作物品种混杂。

（3）配饵时，视季节要求将清水兑入已醇化的毒鼠磷乙醇中，加入适量的糖精，充分搅匀后，立即徐徐倒入已炒好的饵料中，边倒边搅拌，务必力求均匀。

（4）腊复盖，堆闷1小时，摊开，凉干后备用。

一.主要设备:(1)工业用离心机一台;(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可自制)1台;(3)冰柜1台;(4)搅拌机1台;(5)玻璃器皿:1000ml,500ml烧杯各3只,50ml烧杯 2 只,50ml,500ml量杯各1个;(6)塑料桶若干个。

二.主要试剂:(工业纯度)柠檬酸钠,柠檬酸,葡萄糖,乙醇90%，氯仿,丙酮,氯化钠,磷酸氢二钠,磷酸二氢钠,去离子水或蒸馏水,葡萄糖凝酸胶SephadexG-- 100 和DEAE--纤维素.

三.试剂的配制:

1.抗凝剂配方:(1)柠檬酸钠30g,柠檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升,一般此种是每7ml血液,加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液:在1升水中加入0.9克的氯化钠.

2.生理盐水:(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化钠.

3.磷酸盐缓冲溶液的配制:PH7.6,0.2M磷酸盐缓冲溶液,一般用Na2HPO4.H2O,35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升,前者加87.0ml,后者加13.0ml混合后即为PH=7.6 缓冲溶液,如果用K2HPO4.3H2O为45.644g/升,NaH2PO4.2H2O为31.21克/升,仍是前者87.0ml,后者13.0ml混合后即得.

4.冷却剂:在本工艺中有使用-15度低温,一般用如下配方:用33克食盐加入100克雪或碎冰,以此比例配成混合体可达-21.3度。

四.工艺流程

(一)除血红蛋白

1.血液抗凝处理,在新鲜牛,马,猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂,并缓慢搅匀,每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂.

2.把抗凝处理的血液放入离心机,以3000r/min离心约15--20分钟, 用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉,下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次,在每一次洗涤中,用离心机以3000r/min离心,7--8分钟,反复操作后,得到洗涤血红细胞,洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活,在血液量大, 处理不完时必须这样做.

3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水,剧烈搅拌30分钟,使红血球细胞壁砍碎,以使其内的SOD浸出.{zh0}在0--4度静止过夜后,把溶血进行有机提取.

4.接着向溶血中缓缓加入0.2--0.25倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍预冷氯仿,搅拌10--15分钟后,原溶血呈浆糊状,静止1--2小时,用滤布除去凝固的血红蛋白,然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀, 此时如果上清液略为微黄色时,可用快速过滤纸过滤,可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液

二)粗酶液的初步提纯:

1.丙酮提醇:向酶液中加0.8倍量预冷(-15度 ) 丙酮 , 生成大量白色沉淀 , 以3000r/min离心2分钟收集沉淀,上清液可不必吸取,直接倾倒.

2.热变性:(除杂蛋白)准备好衡温浴锅,在本工艺中,提前30分钟, 注满水接通电源后,使之加热到55--60度以省时间,将沉淀量约50倍量体积比加入0.2MPH=7.6磷酸钠缓冲溶液,水浴加热至60度,15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2 分钟得上清液,在上清液中,缓缓滴加0.6倍体积的预冷(-15度)丙酮,生成白色沉淀

3.初纯SOD:在上述沉淀中加去离子水,制成20--30%SOD溶液,分装入样品瓶中,放入冷冻干燥机中,于开机后以0.2--0.1Torr真空度,约1.5--2小时, 得到化妆或食品用SOD,该产品比活大于3000u/mg,外观呈微带蓝色的白色冻干品.

(三)SOD进一步提纯:

SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析,柱层析后的SOD没有小分子等杂质, 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高,它主要作为生物化学试剂, 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种,二者可单独使用,也可结合使用,一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析,将(二)2,热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6,0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解,有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀,上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm),梯度洗脱 , 洗脱液为PH7.6,0.2M,NaH2PO4--NaHPO4缓冲液,下流速度控制在0.2--0.5ml/min,在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液,合并活力峰,再用蒸馏水反复透析,透析彻底后, 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品.

五.注意事项:

1.掌握适当的温度和时间:虽然SOD对热较稳定, 但在分离纯化过程中{zh0}还是采用较低温度,一般以0--10度为宜,时间长不要超过3天.

2.注意提取,提纯方法:使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质, 但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到{zj0}效果.

六.SOD的检测方法:活性检验,比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法, 先测得连笨三酚的自氧化速率,然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率,按照酶活性单位定义,即在{zj0}条件下,每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50% 的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值 ,同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度,看其分子量32000左右的一条带是否与有关文献指导一致.

超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 简称SOD)是一种重要的氧自由基xx剂，作为一种药用酶，引起国内外生化届和医药届的极大关注。SOD应用于医学临床上可以xx多种疾病，类风湿性关节炎、心肌梗塞等，在防辐射，抗衰老，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品和食品添加剂的行列。

自１９６９年Ｍccord和Ｆridovich 首次发现从牛血细胞中发现超氧化物岐化以来，到目前为止，国内已有几十家科研单位对SOD作了大量的研究和试产工作，而且有些已批量生产。SOD引起了国内生化界的重视，１９８８年在浙江宁波如开了《全国首届SOD学术会议》。1989年4月在河南开封《第三届药用酶学术会议》上，SOD被列为重点开发项目，90年7月在大连《全国第二届SOD学术会议》，SOD已作为一种药用酶发展较快，将成为一种很有前途的生化产物。

SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过２０种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。

我国从牛、马、猪、鸡、狗等动物血中提取SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便，药细胞膜易破，用常规分离纯化法可获得高纯度的SOD。

本技术采用热变性，超滤新技术，不仅大大简化了工艺过程，而且产品质量和收率都比老工艺有较大的提高，其提取的SOD均为ＣuＺu-SOD

一、药品与仪器：

(１)柠檬酸三钠：Ｎa3Ｃ6Ｈ6Ｏ7 (２)工业丙酮ＣaＨ6Ｏ

(３)邻苯本酚 (４)酸磷钾Ｋ3Ｐoe4

(５)弱碱性阴离子交换剂ＤＥＡＥ Ｓephadsxa-50外观40-120ubrd或者ＤＥＡＥ-cell-ujose(ＤＥ-32)二乙基纤维素。 (６)冷冻干燥器(自己组配)

(７)层折柱(７.５＊３０cm) (８)离心机

以上试剂及其它药剂、仪器可在各省市化学试剂商店、医疗器械商店购买。

二、Ｃu、Ｚu-SOD的提取及纯化(牛、马血为例)

１、工业流程：

加抗凝剂 盐洗

鲜牛血--------------------->红血球------------------------>

离心除黄色血浆 加ＮaＣＬ

热变性１ 热变性２

压积红细胞-------------->淡黄色混合液--------------------->

68度30分钟 60-65度20分钟

加丙酮 加丙酮 层析

浅蓝色清液----------->絮状沉淀-------------->沉淀------------>

冻干

透析除盐

洗脱----------------->透析液--------->SOD(冻干品)

２、提取方法

(１)收集红细胞：鲜牛血１００升，加入３. ８％柠檬酸三钠抗凝剂搅拌均匀，静置，使红细胞自然沉降，除去上层大部分血浆，下层液再离心除尽其余血浆，再加入３倍量０.９％氯化钠(精制食盐)洗涤两次， 离心可收集到压积红细胞(４０升)。

(２)热变性１：收集的红细胞再加入４公斤氯化钠，４０克氯化铜，蒸馏水１００升搅匀，水浴加热到６８度恒温３０分钟，迅速冷却加至室温，过滤除沉淀，收集滤液。

(３)热变性２：滤液在６５度恒温水浴下，向滤液中慢慢中入４０克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温２０分钟，迅速冷却至室温，离心去沉淀得上清液。

(４)SOD粗品：超滤心清液加入０.７５倍全积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀于离于水，离心除去不溶物得清液，清液加入０.７５倍体积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀，沉淀经无水丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得淡蓝色粉末状SOD粗品

(５)SOD粗品提纯：SOD粗品溶于２.５mmol/L，ＰＨ值７.６磷酸钾缓冲液，将该混合液上在７.５＊３０cm的层柱上，离子换剂为ＤＥＡＥ-ＳphadexＡ-５０(该柱事先用缓冲平衡)，以１００～２００ml/小时速度上样，完毕后用同一缓冲Ａ２８０mm值，低于０.０２然后用２５～２００mmol/L，ＰＨ值７.６磷酸钾缓冲液进行直线梯度分段洗脱，流速为１００ml/小时。用部分收集器收集， 洗脱液经透析除盐后，得浓缩的透析液，经冷冻干燥，得SOD成品，(呈浅绿色)。

三、SOD活性测定：

SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(Ｏ２)这样就可以利用SOD分例(Ｏ２)。阻止中间物的积累而测定其酶活性。

１、试剂及仪器

(１)邻苯本酚分析纯，用１０mmol/LECL配成５０mmol/L溶液。

(２)ＵＶ－７５４紫外分光光度计。

２、测定方法：

(１)邻苯三酚自氧化速度的测定。

在２５度、４５ml`５０mmol/L、ＰＨ值８.３、Ｋ２ＨＰＯ４－ＫＨ２ＰＯ４缓冲液中加入１０mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径１cm的比色杯内，在３２５mm波长下每隔３０秒测Ａ值一次，要求自氧化速度控制在０.０７００d/mm 左右。

(２)SOD或粗酶抽提液活性测定：

测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。

０.０７００－Ａ３２５mm/min

----------------------------------------＊１００％度

０.７０

样液稀释倍数 样液稀释倍数

酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------

５０％ 样液体积

３、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：

SOD或粗酶抽提液，经２８０mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。

蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊１０负３次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。

４、比活(u/mg蛋白)的计算：

单位活力(u/ml) 总活力

比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白

蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白

四、Ｃu、Ｚn－SOD性质：

１、Ｃu、Ｚ n－SOD呈蓝绿色，分子量在３２００左右，由两个中一个Ｃu和一个Ｚn。

２、对热稳定，xx牛血SOD，７５度下加热数分钟其酶活丧失很小。

３、ＰＨ值对SOD的影响，SOD在ＰＨ５.３～１０.５范围内，其催化速度不受影响，ＰＨ３.６时SODＺn脱落９５％，ＰＨ１２SOD构象发生不可递的构象，导致酶活性丧失。

４、SOD的紫外线吸收特征：SOD在２８０mm处没有吸收高峰。

５、金属辅其与酶活性。SOD属金属酶Ｚn仅于分子结构有关，而Ｃu与催化活性有关。

６、SOD是其具有还有和失活作用的。

五、药品与仪器：

柠檬三钠，分析纯：江苏花桥北工四厂；

工业丙酮：上海溶剂厂；

邻苯三酚，分析纯：贵州遵义化工厂；

六、SOD的包销单位：

(１)河南郑州国营圣科研究所郑州南阳路１４号 邮编：４５００５３《河南科技报》９１年１０月３日

(２)四川省金堂县工艺制品技校生化科接待室：金堂准口执行的院内，政府办公大楼１楼 邮编：６１０４０４ 联系人：邓勇 彭丽 《四川农村报》 91年３月１日

(３)广东省深圳市上步区石夏东二苍１４号科技所 邮编：518031联系人：黄秋林 《科技消息报》92年7月10日

说明：１、资料后附的产品销售地址信息均为我们从近两年的报刊上摘录的各单位广告，并注明有出处。

２、你先看完资料后，行根据自己的实际情况，先小量试验， 并事先联系好产品的收购单位，待取得经验后再批量生产。

３、读者在联系收购单位时，请一定事先去联系，并附上邮资， 待得到明确答复后再根据情况去人办理，千万不要冒然前往，以免造成不必要的经济负担。

４、原料及仪器各地经营原料店供应，广州市人民南路，上九路等地均有供应。

附：详细SOD收购信息

１、广西南宁市生物化学制药厂

地址：鲁班路１号

２、上海生物化学制药厂

地址：海主路５１３号

３、江苏徐州市生物化学药厂

地址：海沛路８６号

４、山东兖州市生物化学制药厂

地址：肉联厂内

５、湖南常德生物化学制药厂

地址：肉联厂内

６、佛山市生物化学制药厂

地址：佛山市

７、广州市明兴制药厂

地址：广州市河南路工业大道北４８号

８、广州市白云制药厂

地址：从广州越绣公园坐２１路车到三元里北展下车沿着矿泉别墅侧入２００米

９、哈尔滨生化药厂哈肉联厂

地址：哈尔滨道外南极街１２号院；电话：８８４２３转制药厂

１０、沈阳市生物化学制药厂

地址：哈尔滨皇姑区明廉路２号；

１１、江苏省南京生物制药厂

地址：江苏省南京市下关区宝塔桥附近；

１２、浙江省金华生物化学制药厂

地址：浙江省金华市河盘桥路５１号

１３、广东生物制药厂

地址：广州市三元里

１４、广东汕头市生物化学制药厂

地址：湖山路西巷３号２号；电话：６６６１２４

１１、江苏省南京生物制药厂

地址：江苏省南京市下关区宝塔桥附近

１２、浙江省金华生物化学制药厂

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地址：湖山路西巷３号15.上海霞飞日用化工厂

16.北京丽源日用化工厂

17.南京化妆品厂

18.上海日用化学品二厂

19广州美容化妆品厂

20南京第二xx化学制药厂

上海永芳日用化学品厂

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天津市津乐制药厂

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