【摘要】目的建立红车轴草总异黄酮粉剂中总异黄酮含量的测定方法，从而对该品进行质量控制。方法采用紫外分光光度法直接测定粉剂中总异黄酮含量，测定波长为250 nm。结果回归方程为：Y＝0.131 2 X＋0.009 5，相关系数r＝0.999 7，平均回收率为98.3%，RSD为2.06%，线性范围为1.004 0～5.020 0 mg/ml。结论紫外分光光度法测定该粉剂中总异黄酮含量结果准确、方便、快捷、重现性好。 
【关键词】紫外分光光度法；红车轴草粉剂；总异黄酮
中药红车轴草Trifolium pratense L.为豆科车轴草属多年生草本植物的干燥花序及带花枝叶,又名红三叶红花苜蓿三叶草等［1］，在我国大部分地区均有生产，主要含有蛋白质、氨基酸、糖类、维生素和异黄酮等成分，其中异黄酮具有抗肿瘤（胃癌、乳腺癌）和xx骨质疏松、更年期综合征［2］、抑制前列腺癌和骨髓白血病细胞的生长、改善动脉血管的柔顺性［3］等多种功能。随着对研究的深入，目前国内外科学家已从红车轴草中发现了四十多种异黄酮类化合物，主要是大豆黄素、染料木素、刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A等及其相应的苷类。目前关于红车轴草及其提取物中异黄酮报道较少，大多只测定了刺芒柄花素和鹰嘴豆芽素A。红车轴草总异黄酮粉剂由中药材红车轴草经现代制药工艺提取、浓缩、干燥、粉碎而成。本文对该粉剂中总异黄酮的含量测定进行了相关研究。
1  仪器与试药
 紫外可见分光光度计： UV2450PC（日本岛津公司）；红车轴药材购自广东清远药材市场，红车轴草总异黄酮粉剂由实验室自制，芒柄花素对照品由中国药品生物制品检定所提供。甲醇（色谱纯），水（重蒸水），其他试剂均为分析纯。
2  方法与结果
2.1  样品的制备取红车轴草药材，粉碎成粗粉，加85%甲醇浸泡2 h后回流提取两次，2 h/次。将提取液吸入减压浓缩罐中，减压回收至相对密度1.05～1.10（50℃）。浓缩液冷却后静置分层，倾出上层药液，下层沉淀待处理；上层药液加5倍量水，搅拌30 min后离心处理。离心后所得沉淀与上述浓缩液下层沉淀合并，加6倍量溶剂于室温下脱脂3次，每次搅拌30 min后静置1 h，吸除上层溶剂，下层脱脂沉淀物60℃真空干燥后用醋酸乙酯?乙醇混合溶剂加热回流提取2 h，冷至室温后滤过，滤液减压浓缩至所加混合溶剂体积的1/12，冷至室温后再静置8 h，滤过，沉淀物60℃真空干燥，粉碎，将样品用甲醇配成适当浓度溶液即得。
2.2  测定方法的选择根据化学成分研究结果，红车轴草含有黄酮类成分、蛋白质、糖类、脂溶性色素和少量的甾醇类等成分，本品经纯化后，主要含芒柄花素、鹰嘴豆芽素A等异黄酮类化合物及少量的脂溶性色素成分。这些异黄酮类化合物在紫外区具有很强的特征吸收，因此选择紫外分光光度法测定本品总黄酮的含量。
2.3  对照品的选择根据化学成分研究结果，芒柄花素（formononetin）是本品含量{zg}的成分，因此选择芒柄花素作为本品含量测定的对照品。
2.4  测定波长的选择将样品和芒柄花素对照品用甲醇配成适当浓度，在200～400 nm范围内扫描，两者{zd0}吸收波长均在250 nm ，因此选择250 nm作为本品的测定波长。
2.5  线性关系和回归方程精密称取芒柄花素对照品10 mg，置10 ml量瓶中，加适量的甲醇溶解并稀释至刻度。精密吸取该溶液0.5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得每毫升含0.05 mg的芒柄花素对照 品溶液。准确吸取芒柄花素对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，以甲醇为空白对照，于250 nm波长处测定吸收值。以吸收度为纵坐标，对照品浓度为横坐标，绘制标准曲线。其线性关系和回归方程为：Y＝0.131 2 X＋0.009 5，相关系数r＝0.999 7，线性范围为1.004 0～5.020 0 mg/ml。
2.6  提取溶剂的选择粉剂中所含的异黄酮类成分在甲醇、乙醇、丙酮等溶剂中均有较好的溶解度，因此我们对甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、丙酮和50%丙酮进行了考察。http://www.dxlww.netxxxx网
 具体方法为：精密称取样品5份，每份50 mg，分别置于100 ml具塞锥形瓶中，精密加入甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、丙酮和50%丙酮各50 ml，密塞，称定重量，超声处理20 min，再称定重量，补足减失的重量，摇匀 ，滤过，精密吸取滤液1ml，置10 ml量瓶中，于水浴上挥干溶剂，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取该溶液0.5 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以甲醇为空白对照，于250 nm波长处测定吸收度，计算总异黄酮含量。结果表明甲醇提取的含量测定值{zg}，故选择甲醇为含量测定时的提取溶剂。
2.7  提取方法的选择 含量测定中，常用的提取方法有回流提取法、索氏提取器提取法和超声提取法。以甲醇为溶剂，对这3种提取方法进行了考察。结果表明超声提取效果{zj0}，因此选择超声提取。
2.8  提取时间的选择以甲醇为溶剂，对超声提取法的提取时间进行考察。结果表明超声提取20 min以后，含量不再增加，因此选择提取时间为20 min。
2.9  稳定性实验样品配制后分别在0，1，2，3，4，5，6h，测定吸收度，(见表1)。结果表明样品在6 h内稳定。表1  稳定性实验结果（略）
2.10  精密度实验取同一批号样品的供试品溶液，连续测定5次（见表2）。结果表明仪器精密度良好。表2  精密度实验结果（略）
2.11  重现性实验精密称取同一批号的样品5份，测定吸光度（结果见表3）。结果表明样品测定重现性好。表3  重现性实验结果（略）
2.12  加样回收实验精密称取样品5 mg（总异黄酮的含量为604.8 mg/g），置25 ml三角瓶中，加芒柄花素对照品溶液3.0 ml（浓度为1.004 mg/ml），充分吸附后，置水浴上蒸发至干，再精密加入甲醇10 ml，称定重量，测定吸光度，计算回收率（结果见表4）。平均回收率为98.3%。表4  加样回收实验结果（略）
2.13  4批中试产品的测定精密称取供试品适量，配成供试品溶液。照拟定的测定方法测定，同法做空白实验，照分光光度法［4］，在250 nm处测定吸收度，计算，即得。结果见表5。表5  4批中试产品中总异黄酮的含量测定（略）
根据测定结果，暂定本品每克含总异黄酮以芒柄花素（C16H12O4）计，不得少于550 mg。
3  讨论
对总异黄酮提取工艺进行了初步研究，结果表明超声提取，用甲醇作提取溶剂，提取时间为20 min，结果较理想。
紫外分光光度法测定该粉剂中总异黄酮含量结果稳定、方便、快捷，可为其他剂型总异黄酮含量测定提供方法借鉴。
【参考文献】
［1］江苏新医学院.中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版,1977:1012.
［2］曾虹燕,周朴华,侯团章.红车轴草有效成分的研究进展［J］.xxx，2001,32(2):189.
［3］Rice L,Samedi V G,Medrano T A,et al.Mechanisms of the growth inhihitoty effects of the isoflavonoid biochanin A on LNCap cells and xenografts［J］.The prostate,2002,52:201.
［4］国家药典委员会.中国药典,Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005:附录ⅤA