实时荧光定量PCR

(Real time fluorescent Quantitative PCR， RT-FQ PCR)

是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，简称FQ-PCR， RT-FQ PCR。

该技术是在 PCR 反应体系中加入非特异性的荧光染料（如： SYBR GREEN ）或特异性的荧光探针（如： Taqman 探针），实时检测荧光量的变化（在目标DNA扩增过程中荧光信号增长）。获得不同样品达到一定的荧光信号（阈值）时所需的循环次数 CT 值（ Cycle Threshold ）；通过已知浓度标准品的 CT 值与其浓度对数绘制标准曲线，就可以准确定量样品的浓度。

FQ-PCR是PCR反应一面进行，一面利用萤光侦测与计算机分析技术记录PCR的反应结果，当反应完成时，检验结果就立即呈现。

实时荧光定量PCR 方法1 ------- SYBR Green  法

SYBR Green  能结合到双链DNA的小沟部位

SYBR Green  只有和双链DNA结合后才发荧光。

变性时，DNA双链分开，无荧光。

复性和延伸时，形成双链DNA，SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。

SYBR Green法优点：使用方便-----不必设计复杂探针，非常灵敏，便宜。

SYBR Green法缺点：容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性 。这些不足之处可以通过融解曲线的分析，优化反应条件，降低或者xx引物二聚体的干扰. 因为引物二聚体的片段一般很小，融解温度通常都比目标PCR产物的融解温度低. 如果在高于引物二聚体的Tm但低于特异产物的Tm的温度下读板，由于引物二聚体已经变性，与之结合的SYBR Green  I（SGI）都脱离下来，因此这个时候检测到的荧光都来自目标扩增序列，这就xx了因引物二聚体而产生的荧光信号. 而在这个温度下，大部分的特异产物仍然保持双链形式与SGI结合. 此时检测到的荧光信号，就没有了因引物二聚体而产生的干扰信号，荧光信号就与特异扩增产物量的关联性更加紧密。

实时荧光定量PCR 方法2 ----TaqMan法

在常规PCR基础上，反应体系添加 “荧光双标记探针”，探针的5′端为荧光报告基团，3′端为荧光淬灭基团，两者构成能量传递结构，5′端荧光报告基团的荧光可被荧光淬灭基团吸收掉，转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。

在目标DNA扩增过程中，探针水解，荧光素和淬灭剂分开，淬灭剂对荧光素的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的增长。

由于探针必须遇到模板才能实现水解，故非特异性扩增不会被检测。

实时荧光定量PCR 方法3 ---分 子 信 标法

在目标DNA扩增过程中，分子信标型探针构型变化，荧光素和淬灭剂分开，淬灭剂对荧光素的抑制作用消失，从而引起报告基团荧光信号的增长。

实时荧光定量PCR对起始DNA的定量方法为：

原理：初始 DNA量越多, 荧光达到某一值（ Ct阈值）时所需要的循环数越少。

Ct值和初始DNA量的对数值呈线性关系。制定标准品的Ct值和初始DNA量的对数值之间的标准曲线。根据样品的Ct值就可准确定出起始DNA数量。