羟苯磺酸钙降低血肌酐机制的研究

刘新明　刘晓城

　　肌酐是人体内肌酸的代谢产物，正常人肌酐的排泄主要通过肾小球的滤过作用。血清肌酐的xx是评价肾功能的一个重要指标。近年来我院临床资料证实羟本磺酸钙有降低血肌酐、尿素氮、尿酸等作用，特别是降低血肌酐作用尤其显著。其具体机制国内外尚未见报道，为阐明羟本磺酸钙对肌酐的作用机制，本组在糖尿病大鼠中进行了羟本磺酸钙对血肌酐的实验研究。现报告如下：

1　材料和方法

1.1　xx和试剂

　　羟苯磺酸钙由西安利君制药提供，用蒸馏水稀释至实验浓度。链脲佐菌素(STZ)购自美国Sigma公司，以0.1mol／L，pH4.2枸椽酸缓冲液溶解新鲜配制。

1.2　实验动物及分组

　　40只雄性sD大鼠，体重200～250g(华中科技大学同济医学院动物中心提供)。大鼠饲养7d后随机分为，正常对照组(A组，6只)，正常给药组(B组，6只)及实验组。实验组经过高糖、高脂饮食28d后，分两次小剂量腹腔注射STZ(30mg／kg)。第二次给药72h后将血糖≥16.7mmol／L，尿糖强阳性，胰岛素敏感指数(INS)下降选定为2型糖尿病实验动物，再将其随机分为2组，糖尿病对照组(C组，6只)、羟苯磺酸钙xx组(D组，6只)。D组以羟苯磺酸钙每日100mg／kg灌胃，A、C组同时灌服蒸馏水。动物单笼饲养，自由进食、饮水。给药24周后收取24h尿液，xx后下腔静脉取血，摘取双侧肾脏，称重，取部分皮质固定于4.0％的多聚甲醛，部分固定于3.7％戊二醛液。

1.3　生化指标的检测

　　血糖用美国强生公司血糖仪测定，全自动生化分析仪测定血肌酐(Scr)、尿肌酐(Ucr)。计算内xx酐xx率(Ccr)，Ccr=Ucr×尿量／Scr，并校正体重，尿蛋白采用双缩脲法。

1.4　肾脏病理分析

1.4.1　光镜检查　新鲜的肾脏去除包膜后，以10.0％中性福尔马林固定24h，常规石蜡包埋切片，行HE，PASM，Masson染色，由专职病理医生读片分析。PASM切片用于形态学定量分析，每片随机选取10个正切的肾小球，用多功能真彩色病理图像分析系统进行分析，测定肾小球直径和系膜区密度(系膜区面积，肾小球面积)。电镜标本采用断面宽度法测定肾小球基底膜(GBM)厚度。每组随机取30条GBM，每条随机取10个点测量厚度，以平均值表示该组GBM厚度。

1.4.2　免疫组化　按试剂盒操作步骤，行免疫组化染色。PKC，TGF-β1，type Ⅳ Collagen免疫组化表达采用半定量分析方法，随机选择10个肾小球和10个视野肾小管间质，根据光镜下染色在肾小球和肾小管中的分布分为0-3分，即0分：无染色；1分：偶有染色；2分：局灶染色；3分：弥漫染色。然后取其均数，用于统计分析。

1.5　质子谱分析法

　　采用美国菲根LCQ Delta XT质子谱分析仪，抽取血透病人透析后废水(病人未使用羟苯磺酸钙)，加入羟苯磺酸钙原粉，由专业技术人员分析质谱情况。

1.6　统计学分析

　　所有实验数据以±表示，采用SAS11.0软件进行分析，组问差异用方差分析法检验，以P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异非常显著。

2　结　　　果

2.1　一般情况

　　C和D组大鼠实验期间均出现多饮、多食、多尿及糖尿，明显高于A和B组。

2.2　各组大鼠血糖、肾功能、尿蛋白、血管紧张素Ⅱ、尿量、肾重，体重、肌酐xx率比较

　　C和D组上述指标较A和B组明显升高，C和D组间血肌酐差异非常显著(P＜0.01)、尿素氮差异显著(P＜0.05)，D组较C组明显降低。C组和D组间的尿蛋白、血管紧张素Ⅱ、尿量、肾重，体重、肌酐xx率无差异。A和B组间上述指标无显著差异。见表1。

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2.3　羟苯磺酸钙对PKC、TGF-β1、type Ⅳ Collagen的影响

　　C和D组PKC，TGF-β1，type Ⅳ Collagen的表达较A和B组明显增加，D组较C组表达明显减少。见表2。

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2.4　病理学改变

　　PASM染色光镜显示D组系膜区较C组明显缩小(P＜0.05)。电镜观察到D组基底膜增厚较同期C组减轻(P＜0.01)。见表3。

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2.5　质子谱分析结果

　　在分子量为301，691，545，559和579处形成峰值，且继续敲击，691，545，559和579可分解，都在301处形成一峰值。经分析，分子量为301处是肌酐和羟苯磺酸基团结合物。但尿素氮和羟苯磺酸基团没有形成峰值。

3　讨　　　论

　　本实验采用分次STZ腹腔注射加上高糖、高脂饮食建立2型糖尿病大鼠模型，大鼠血糖、尿蛋白水平、相对肾重明显升高，表明本研究建立的DM模型肾脏病变与大多数文献报道的大鼠DN的表现较为吻合。

　　如前所述，肌酐是人体内肌肉酸的代谢产物，肌酸生成后由血液循环带到肌肉组织。在肌肉中，肌酸在肌酸磷酸激酶的催化下转变成带高能磷酸键的磷酸肌酸，肌酸量与肌肉成正比。磷酸肌酸不稳定，容易脱去磷酸、脱水转变成肌酐。肌酸激酶(CK)又称磷酸肌酸激酶，主要存在于骨骼肌和心肌中，它有3种同工酶，即CK-BB，CK-MB及CK-MM。骨胳肌及心肌中CK-MM占{jd1}优势，正常血清中绝大部分为CK-MM的活力；含有少量CK-MB，不超过总活力的5.0％；CK-BB含量微乎其微，用一般方法测不出。在骨骼肌损伤和一些肌萎缩患者中，CK改变较明显。本实验研究证实糖尿病模型组和xx组及对照组间的CK无统计学差异；在肌酐的来源方面，对照组、模型组、xx组间也无统计学差异。

　　从Ccr来看，实验组较正常对照组高，表明DM大鼠肾脏损害处于高滤过期。但糖尿病羟苯磺酸钙xx组较糖尿病对照组无差异，由此也可说明羟苯磺酸钙降低血肌酐水平不是通过高滤过作用引起的。

　　从病理结果来看，本实验结果显示，2型DM大鼠24周后尿素氮、肌酐、尿蛋白、肾重，体重比增加、肾小球基底膜增厚，以肾小球系膜区为主的细胞外基质积聚，说明本型已出现DN的典型病理改。糖尿病羟苯磺酸钙xx组大鼠的肾小球基底膜增厚程度较同期糖尿病对照组减轻，以肾小球系膜区为主的细胞外基质积聚减少，PKC，TGF-β1，type Ⅳ Collagen在肾脏的表达明显减少，表明羟苯磺酸钙有抑制PKC，TGF-β1，type IV Collagen的作用。

　　通过质子谱分析仪的检测可以得知，羟苯磺酸钙分子结构为，它离解成2个基团，肌酐可以和1个基团结合生成一种新的物质，这种新的物质结合较牢固，它还可以继续与其它中小分子结合。羟苯磺酸钙和肌酐的结合势必导致血肌酐水平有一定程度下降。基团和尿素氮没有结合，这也说明羟苯磺酸钙降低肌酐作用较降低尿素氮作用更明显。但这种化学结合是如何结合，又如何通过肾小球滤过等，还有待实验证实。

　　总之，羟苯磺酸钙使血肌酐水平下降，至少包含两种机制，即通过化学结合和改善了肾脏的病理结构，两者协同作用。但是否还有其它机制，尚待进一步研究。

作者单位：华中科技大学同济医学院附属同济医院肾内科，湖北武汉 430030

来源：《中国现代医学杂志》第14卷第24期