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分类号 R911 单位代号 10183
密级内部 研究生学号 9712010
硕士学位论文题目抗乙肝特异性转移因子的性质研究
作者姓名: 刘刚
专业: 微生物与生化药学
导师姓名
及 职称: 林永齐教授
吉林大学二零零零年六月吉林大学硕士学位论文 抗乙肝特异性转移因子的性质研究
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谨以此文感谢
长春高斯达生化药业股份
有限公司
对本课题的大力资助
吉林大学硕士学位论文 抗乙肝特异性转移因子的性质研究
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目录提要 1
英文缩略词表 2
{dy}部分 前言 1
(一) 病毒性肝炎及乙型病毒性肝 1
(二) 病毒性肝炎的xx 8
(三) 转移因子 11
第二部分 材料与方法 20
(一) 实验仪器 20
(二) 实验材料与试剂 20
(三) 实验方法 21
1. 抗乙肝特异性转移因子的制备 21
2. 多肽测定方法 22
3. 核糖测定方法 24
4. 定磷实验 25
5. 抗乙肝特异性转移因子的 N-末端修饰测定方法 26
6. 抗乙肝特异性转移因子的活性测定方法 28
噻唑蓝-白细胞粘附抑制实验
第三部分 结果与讨论 30
(一) 抗乙肝特异性转移因子的理化性质研究 30
1. 抗乙肝特异性转移因子的分离与纯化 30
2. 抗乙肝特异性转移因子的多肽、核糖及定磷实验测定结果 32
3. 抗乙肝特异性转移因子的紫外吸收光谱 32
4. 抗乙肝特异性转移因子中碱基的红外光谱分析 33
5. 抗乙肝特异性转移因子的氨基酸分析结果 34
6. 抗乙肝特异性转移因子的 N-末端修饰测定结果 36
(二)抗乙肝特异性转移因子的活性研究 37
1. 抗乙肝特异性转移因子的促抗体生成细胞(B 淋巴细胞)功能的检测 37
2. 抗乙肝特异性转移因子的促干扰素产生功能的测定 39
3. 抗乙肝特异性转移因子的促淋巴细胞转化功能的测定 41
4. 抗乙肝特异性转移因子的促巨噬细胞吞噬功能的测定 42
5. 抗乙肝特异性转移因子的促白细胞粘附抑制因子产生实验 44
6. 抗乙肝特异性转移因子的噻唑蓝-白细胞粘附抑制实验结果 45
第四部分 结论 48
参考文献 49
致谢 1
摘要 ⅰ
英文摘要 ⅳ
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提要本文利用 Sephadex G-25 层析方法对抗乙肝特异性转移因子进行分离纯化,
并对所得的四个组分进行了相应的生物化学性质研究,结果表明,抗乙肝特异性
转移因子为多肽和腺嘌呤单核苷酸的复合物,并含有少量的游离氨基酸;其中
OD260/OD280 比值较高的组分 2、组分 3 中,腺嘌呤单核苷酸以较弱的方式连接在
多肽链的 N-末端氨基酸 His、Ser 上.
此外,本文还对抗乙肝特异性转移因子的体外活性进行了一系列的研究,结
果表明抗乙肝特异性转移因子在体外可明显促进机体免疫功能的增强,如促进淋
巴细胞转化、促进 B 淋巴细胞产生抗体等.同时,确立了对抗乙肝特异性转移
因子体外活性的测定方法:白细胞粘附抑制试验.并且利用该方法确定了抗乙肝
特异性转移因子的活性组分为组分 2、3,而组分 4 对抗乙肝特异性转移因子的
体外活性具有抑制作用,这些研究对日后对抗乙肝特异性转移因子的进一步分离
纯化提供了理论依据.
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英文缩略词表
TF 转移因子
HBV 乙型肝炎病毒
HBsAg 乙型肝炎病毒表面抗原
HBV-DNA 乙型肝炎病毒脱氧核糖核
PPD 结核杆菌提取物
DTH 迟发型变态反应
DLE 可透析的白细胞提取物
MTT 噻唑蓝
LAIA 白细胞粘附抑制实验
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{dy}部分 前言(一) 病毒性肝炎及乙型病毒性肝炎
1. 病毒性肝炎
凡是能引起肝脏损害,出现肝功能异常的肝脏炎症性疾病,统称为肝炎.引
起肝炎的原因是多种多样的,常见的有以下几种:
(1) 病毒性肝炎: 是由各种嗜肝性病毒引起的肝炎.
(2) 酒精性肝炎: 是因长期大量饮酒引起的肝炎.
(3) xx性肝炎: 是因对肝脏有损害的xx引起的肝炎.
(4) 自身免疫反应性肝炎: 是由于机体免疫功能紊乱引起的肝炎.
在现实生活中我们常说的肝炎,主要是指病毒性肝炎.临床上所说的病毒性
肝炎,是指一组特殊的嗜肝病毒侵袭人体后,呈现在全身或某些系统造成的损伤,
但主要病变则局限于肝脏,故而将这种嗜肝病毒产生的肝炎称之为病毒性肝炎.
目前已知有五种主要肝炎病毒:甲肝病毒产生甲型(A 型)病毒性肝炎(简称甲
肝)、乙肝病毒产生乙型(B 型)病毒性肝炎(简称乙肝)、丙肝病毒产生丙型(C
型)病毒性肝炎(简称丙肝)、丁肝病毒产生丁型(D 型)病毒性肝炎(简称丁
肝)和戊肝病毒产生戊型(E 型)病毒性肝炎(简称戊肝).其中 B 型病毒、C
型病毒和 D 型病毒所引发的肝炎可发展为慢性肝炎和肝硬化,甚至可演变成原
发性肝细胞肝癌.
按1991 年在上海召开的肝炎会议规定;将病毒性肝炎按病原学分为甲肝、
乙肝、丙肝、丁肝、戊肝.根据其临床表现特点临床分为:
(1)急性肝炎:①急性黄疸型肝炎;②急性非黄疸型肝炎.
(2)慢性肝炎:①慢性迁移性肝炎(简称慢迁肝);②慢性活动性肝炎(简称慢
活肝).
(3) 重症肝炎:①急性重症肝炎;②亚急性重症肝炎;③慢性重症肝炎.
(4) 淤胆型肝炎.
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2.乙型病毒性肝炎简介
乙型病毒性肝炎(简称乙肝):潜伏期为 6 周至 6 个月,多呈慢性发病,无
黄疸型为多.
急症无黄疸型肝炎的主要症状:全身无力,食欲不振,腹胀,肝区痛等,部
分病人有恶心、呕吐、腹泻等.关节酸痛.少数病人(8-12%)可无任何症状,
只在检查时,因血清谷丙转氨酶升高或肝脏肿大,才被发现[1]
.
急性黄疸型肝炎的症状:除上述症状外,在病程一个月左右,巩膜和皮肤出
现黄疸,皮肤可有搔痒,小便呈现深褐色,整个黄疸期持续 2-4 周,随着黄疸的
消退,病人进入恢复期平均约一周左右.大多数 2-4 个月可恢复健康[2]
.
重症黄疸型肝炎的症状:肝脏缩小(肝细胞大量坏死),有全身出血倾向,
最突出的是出现xxxx症状,如烦躁不安、尖声喊叫、精神错乱、嗜睡、昏迷
等.称为急性重症肝炎,愈后很差.
亚急性重症肝炎,病情也较重,但病程较急性重症肝炎为长,常达数周或数
月,部分病人可发展成坏死性肝硬化[3]
.
慢性肝炎是由于感染乙肝后病情不见好转,超过半年,反复出现肝区痛,饮
食不振,身疲乏力,腹胀等症状,肝脏肿大,有压痛,肝功能反复不正常,分为
慢性迁移型肝炎和慢性活动型肝炎.而慢性活动型肝炎一般情况较差,见有肝病
面容(面色黎黑),肝掌(手掌红斑)或蜘蛛痣(皮肤血管扩张所致),肝脏质地
较硬,脾肿大等.化验检查血清谷丙转氨酶( ALT 或GPT)持续或反复升高外,
麝香草酚浊度(TTT)和锌浊度(ZnT)也有明显异常;血清白蛋白降低(正常
为30-55g/L),球蛋白升高(正常为 25-35g/L), 血清白蛋白/球蛋白比值失常.
部分病人可有多系统损害,如关节炎、肾炎、皮疹、干燥综合症等表现.诊断本
病并不难,根据接触史、症状、体症和肝功能检查综合考虑,如血中两对半检验,
有助于乙肝的诊断.如乙肝引起的肝硬化有演变成原发性肝癌的可能,所以慢性
乙肝患者应定期去医院检查[4]
.
乙肝的传染途径,主要通过母婴或注射途径传播.应用被污染的血制品及消
毒不严格的医疗操作,患者的唾液,鼻炎分泌物,血栓分泌物,精液等也有传染
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性,婴儿时期被传染的慢性乙肝,不容易根治.
感染乙肝病毒之后,如人体免疫功能正常,乙肝病毒数量少时毒力较弱,受
损的肝细胞少,表现为无黄疸型肝炎,如病毒数量较多,毒力较强,受损的肝细
胞多,则表现为黄疸型肝炎.如人体免疫功能缺损,肝细胞内虽有病毒,但由于
缺乏有效的免疫反应将它杀灭,肝细胞不出现或出现轻微损害,则表现为病毒携
带者.如果人体免疫功能低下,仅能xx一部分病毒,肝细胞不断地受到一定损
害,则表现为慢性肝炎.如果人体免疫反应过强,病毒数量又多,短期内引起大
量肝细胞坏死,则表现为重症肝炎.
3.乙型肝炎病毒和机体免疫反应
3.1 乙型肝炎病毒抗原及免疫识别位点
3.1.1 乙型肝炎病毒的包壳蛋白:
包括 3 种多肽,其羧基终端相同(图1-1),分别称为大、中及主要 HBs 蛋白.大分子包括有前 S1、前S2 及主蛋白,中分子则由前 S2 及主蛋白组成.乙型
肝炎病毒的趋肝性,可能与前 S1 有重大关系.前S1 的21-47 位氨基酸区域可以
和肝细胞膜结合[5]
.最近 Pontisso 发现前 S1 的30-32 位氨基酸附近位关键部位,
可以通过 IgA 的受体和肝细胞膜结合.针对 30-36 位氨基酸的单克隆抗体可以抑
制这种结合作用,很多肝外细胞也有 IgA 受体,如B细胞及单核细胞可以和较
多病毒颗粒结合[6]
.由于前 S1 和病毒进入细胞有关,所以可以理解最近 Neurath
报告前 S1 区的抗体具有中和病毒的作用[7]
.
乙型肝炎病人恢复期血清抗体主要和 HBs 基因编码区结合.有两个亲水区
形成绊状,由分子内的双硫键联接,位于氨基酸 124-147 部位.恢复期血清和抗
原结合能力大部分(>80%)位于此区内[5]
.在猩猩体内,用针对 124-36 区域的
单克隆抗体可防止感染.乙型肝炎恢复期血清和采用血源性或重组疫苗免疫健康
人的血清均含有针对上述区域的抗体[5]
.
Neurath 认为 HBsAg 蛋白质残基 181-196 及254-272 移位于细胞膜,使小分
子HBs 及中分子 HBs 可以排泌出去.而T细胞及 B 细胞对 S 蛋白的识别位点位
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于残基 274-331,B 细胞识别为构型依赖性,要求完整的双硫键,以丝氨酸取代
胱氨酸合成一系列类似多肽,以了解双硫键在 S 蛋白(残基 295-325)中的重要
意义.发现能够引起对 S 蛋白反应抗体的多肽,以残基 295-312,298-312,313-321
间的双硫键作用{zd0}.前S取得抗体结合位点较多,前S1 区包括 12-53,94-119;
前S2 区有 120-153 等.上述位点的抗体具有中和病毒的作用,而前 S1 的多肽 12-47
具有保护作用[8]
.
至于 T 细胞对包壳抗原识别的位点,和抗体有所不同, T 细胞识别的位点
仅为短的线状多肽片断[5]
.T 细胞识别的位点和表型因 HLA 限制性不同而异,
所识别的多为全抗原经细胞内处理形成的短肽(表1-1).HLA 的Ⅰ级抗原限制
的主要为 CD8
+
T 细胞(抑制性/细胞毒性 T 细胞),而Ⅱ级HLA 限制的为 CD4
+
T
细胞(协助性/诱导性 T 细胞).
图1-1 乙型肝炎病毒的包壳蛋白
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表1-1 人HBV 包壳抗原特异性 T 细胞识别位点
包壳抗原 残基 活化 T 细胞的 HLA 限制性
S/P25 19-28 Ⅰ级(9)
前S2 120-134 Ⅰ级及Ⅱ级(10)
126-140 无限制性 (11)
前S1 21-28 Ⅰ级(12)
Milich 发现在小鼠体内协助性 T 细胞识别前 S 或S任何特定区域,均是以
诱导前-S1,前-S2 及S区抗体形成,而且协助性 T 细胞识别 S, 前S1 或前 S2 不受
组织相容抗原(MHC)限制.因此,对S和/或前 S2 区域无影大小鼠经含前-S2
或前 S1 的HBsAg 颗粒进行免疫后,仍可出现抗体应答[8]
.张定凤建立的人 CD4
+
T
细胞克隆,可以协助 B 细胞产生抗 HBs,是受Ⅱ级HLA 限制的[13]
,和Milich
在小鼠体内的结果有所不同.
3.1.2 HBV 的核壳抗原:
包括 HBcAg 及HBeAg.制备分别针对 HBcAg(乙型肝炎病毒核心抗原)
及HBeAg(乙型肝炎病毒 e 抗原)的单克隆抗体,证明两者之间无交叉抑制作
用,表明两者抗原的位点不同[14]
.急性乙型肝炎患者抗 HBc 早期出现,数周或
数月后才出现抗 HBe,抗HBe 出现常和病毒复制终止有关,也可能伴前 C 区的
基因突变.至于 B 细胞识别 HBcAg 的位点,可能位于 107-118 位氨基酸,上述
合成多肽可以和人抗 HBc 血清起反应,免疫小鼠可产生抗 HBc[15]
.上述似无严
格构型性.至于 HBeAg 的B细胞识别位点尚不清楚.
至于 HBcAg 及HBeAg 的T细胞识别位点可能处于同一部分多肽[16]
.两者
在T细胞水平有交叉反应[15]
,在小鼠体内,T 细胞的 HBcAg 识别位点因动物
H-2 的型不同而异(相当于人 HLA).如H-2s
或H-2b
为识别 120-140 残基,而H-2f
及H-2q
为识别 100-120 残基.其中 12 残基多肽,P120-131 及P129-140 能
xx T 协助细胞诱导小鼠产生抗 HBc.至于人体 T 细胞的 HBcAg 识别位点目前
还不清楚[14]
.
3.2 慢性乙型肝炎:
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乙型肝炎慢性化的机理可以分为病原及抗体两方面,多种因素互相作用,构
成慢性乙型肝炎,病情轻重不等.
病原方面:HBV 的基因突变,目前认为和乙型慢性肝炎有重要关系.常见
为前-C 区基因突变,形成终止密码,不能合成 HBeAg,但在 C 区的起始密码仍
能启动,可以合成 HBcAg.如果病毒复制活跃,则病情不断进展.所以在部分
病人血清 HBeAg/抗HB