胡国华  马正智  杨琴

    原子力显微镜(atomic force microscopy，AFM)，是一种利用原子,分子间的相互作用力来观察物体表面微观形貌的新型实验仪器，不同于电子显微镜只能提供二维图像，AFM提供真正的三维表面图。在生命科学中尤其是生命遗传物质-DNA的精细结构研究中，已经得到了极大的xx。近几年来利用原子力显微镜对多糖分子结构的研究发展较快，原子力显微镜被广范应用于观测多糖生物大分子的分子以及超分子结构。 

    在分子水平上研究生物分子相互作用的分子机制，对于深入了解生物分子的特异识别、生化过程以及分子结构与功能的关系具有重要意义，是目前生物、化学、物理交叉领域的一个前沿方向。原子力显微镜法以其独特的优越性在生物分子相互作用的研究中发挥着十分重要的作用。原子力显微镜具有原子级的高空间分辨率，制样方法相对简单，能在接近生理环境的条件下(如溶液中)操作，利用它对生物样品进行高分辨成像，已成为生物学研究的热门技术，正在广泛应用于结构生物学、分子生物学、细胞生物学等各领域。Lee等首先报道了利用AFM皮牛级的测力灵敏度来研究生物分子间的非共价作用，使得传统热力学研究方法无法实现的分子水平上分子间相互作用力的测定成为可能。

   而对κ-卡拉胶和酪蛋白的研究，普遍注重于蛋白质与多糖混合后的流变性质的变化规律等方面，以及利用差热分析方法来探讨相互作用的强弱及相互作用键的种类和稳定性，关于分子级别上的形貌研究甚少。Goff和Morris等通过扫描电镜、投射电镜、激光共聚焦显微镜对卡拉胶分子结构等方面进行了研究。Mclntire等通过原子力显微镜研究了卡拉胶和淀粉酶的分子形貌结构，Takahiro等通过原子力显微镜研究了κ-卡拉胶和ι-卡拉胶在不同阳离子作用下的分子构象。利用原子力显微镜对卡拉胶和牛奶蛋白的构象研究还比较少。

    本文就卡拉胶和牛奶蛋白溶液通过轻敲模式的原子力显微镜进行形貌观察来研究卡拉胶与牛奶酪蛋白分子相互作用情况。

主要实验材料

κ-卡拉胶纯粉，江苏常航胶体有限公司。脱脂奶粉，市售。

主要仪器和设备

原子力显微镜   Multimode IIIa，    美国Veeco公司

实验方法

1.3.1卡拉胶水溶液与牛奶酪蛋白样品的制备

   将κ-卡拉胶加热到90℃保温2-3min直至xx溶解，冷却至60℃，将11%脱脂奶粉溶于其中，在60℃下保温30min后迅速冷却。卡拉胶浓度为100mg/L，用于观测的样品逐步稀释到所需浓度，将制得的溶液采用滴涂的方法固定的云母片上：大约3微升的溶液直接滴在10mm×10mm新鲜剥离的云母片表面，并先在空气中晾置10min，然后放入干燥器中继续干燥。

1.3.2原子力显微镜观测

   采用悬臂长200微米，宽40微米的金字塔型的硅针头，曲率半径小于40nm。接触力控制在3-4 nN量级以内，高度以及相关信息的图像均在2赫兹的扫描速率下获得；原子力图像数据采用256×256点阵存储；图像经自动平滑处理，以xx慢扫描方向上的低频噪音；分子链的高度值由图形中直接获得。所有实验均在大气及常温（25℃）下完成，空气湿度保持在50%左右。

2.1卡拉胶在不同浓度下的分子构象

  xx卡拉胶分子通过氢键的作用聚合在一起，当颗粒溶胀时，氢键被打破，颗粒变的比较松散，最终在溶解过程中彼此解离，分子以单分子链的构象形式存在。为了得到卡拉胶单分子链的图像信息，必须将溶液浓度稀释到很低的倍数，才能将分子链xx解离。因此在本实验中，卡拉胶在蒸馏水中的浓度为1mg/L时，得到的卡拉胶原子力图像如图1所示。由图像中可以看到，卡拉胶呈现比较柔顺的分子链构像，与Takahiro Funami等^{[18 ]}的发现类似，κ-卡拉胶的分子链直径在20nm左右。

   随着卡拉胶溶液浓度的增加，在10 mg/L左右，如图2所示，卡拉胶分子发生聚集，呈现螺旋体结构，从构象上来看，卡拉胶聚集成了颗粒状态。此时观察到的卡拉胶分子链聚集状态，与不同阳离子对胶体保水性实验中SEM结果类似，当不存在离子时，卡拉胶聚集成比较粗壮的胶束结构。而导致这种聚集发生的原因可能是由于形成了分子内和分子间的氢键所致。

牛奶中酪蛋白的分子构象以及和卡拉胶分子相互作用的分子构象

   牛奶中80％-95％的酪蛋白是以胶束形式存在的，包含94％的蛋白和6％的胶态磷酸钙，胶束直径50-500 nm。酪蛋白主要分为α_s1、α_s2、β、κ四种类型，这些酪蛋白与一定数量的胶束磷酸钙以非共价键结合，形成一种称为酪蛋白胶束的蛋白质聚合体，在乳中稳定存在。由图3可以看出，浓度为11%牛奶中的蛋白呈现圆形胶束聚集，很难区分单独酪蛋白的分子构象。由于蛋白颗粒的这种聚集，因此有必要将溶液进行一定的稀释，进而观察游离状态的酪蛋白胶束，以及其与κ-卡拉胶分子之间的相互作用。

   从图4a可以清楚地看到，由两个左右的亚胶束形成的蛋白颗粒，大颗粒直径在在200nm左右，小颗粒直径在100nm左右，与酪蛋白颗粒直径类似。单独牛奶酪蛋白的颗粒的聚集状态，蛋白颗粒呈现相对规则的球形或半球形，我们推测，牛奶中酪蛋白颗粒通过亚胶束之间的疏水作用或范德华力产生聚集。Spagnuoloa等^[14]利用电子扫描显微镜，观察到酪蛋白颗粒直径在250nm左右，与本实验是用原子力显微镜观察结果类似。图4b为κ-卡拉胶存在时的分子构象，从图像中可以看到，大胶束颗粒之间通过一些线形小颗粒相互连接。由图1可知单独卡拉胶单体以线形小颗粒的形式存在，Spagnuolo等利用电子扫描显微镜也观察到了类似的情况。由此我们认为，κ-卡拉胶作为酪蛋白之间连接的桥梁，对于牛奶的稳定起重要的作用。

   图5给出了κ-卡拉胶和牛奶溶液稀释50倍后分子构象变化，从图中可以看到，酪蛋白颗粒呈现不规则形状，颗粒周围附着了一些细长的线形卡拉胶聚集分子。在阳离子对卡拉胶保水性影响实验中，κ-卡拉胶对钙离子的敏感程度仅次于钾离子，由于酪蛋白和磷酸钙之间的连接，当存在κ-卡拉胶时，钙离子和卡拉胶发生连接。因此，酪蛋白胶束之间就形成了，酪蛋白-钙-卡拉胶-钙-酪蛋白的连接状态，从而xx了α_s酪蛋白和β酪蛋白对钙离子的敏感程度。牛乳中酪蛋白胶束包括as₁-，as₂-，β-，κ-酪蛋白，SPagnuolo等^[14]在研究酪蛋白胶束与卡拉胶之间的相互作用时提出酪蛋白胶束的直径大概为200nm，κ-酪蛋白短链从酪蛋白胶束表面突出出来使表面熵{zd0}化，使得酪蛋白之间相互排斥，卡拉胶连接在酪蛋白胶束的κ-酪蛋白短链上，

   防止了α_s酪蛋白和β酪蛋白的聚集沉淀，从而使酪蛋白形成稳定的小颗粒，可见κ-卡拉胶能够稳定酪蛋白的一个重要原因在于，酪蛋白上存在少量的钙离子。

  结论

    本文对于卡拉胶和牛奶蛋白溶液，通过轻敲模式的原子力显微镜进行了形貌观察来考察溶液滴在云母片上的构象信息。我们观测到了不同浓度下，κ-卡拉胶的分子链形态，包括单分子链和分子发生缠绕的聚集状态，发现卡拉胶单分子链的直径在20nm左右，随着浓度的增加，卡拉胶分子产生大量聚集。同时观测了牛奶中酪蛋白与卡拉胶相互作用的分子状态，κ-卡拉胶分子附着在酪蛋白胶束表面，起着连接酪蛋白的作用，xx了酪蛋白所带的电荷，减小了酪蛋白之间的静电引力，有效地阻止了酪蛋白之间的聚集，对酪蛋白溶液的稳定起重要的作用。

                                            ——转自《中国食品添加剂》2010.2.，有删节（包括AFM图）