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HPV58L2的两种原核表达载体的构建和鉴定
2.1  实验材料与方法
2.1.1 实验材料
 2.1.1.1菌株和载体
本课题的基因序列是根据实验需要的HPV58基因组由清华大学深圳研究生院张亚欧教授赠与；大肠杆菌E. coli DH5α和BL21菌株为本实验室实验保存；载体pGEX-KG-4和pET32a（+）购买自Healthcare Life Sciences公司 。
2.1.1.2  主要试剂
试剂 购买公司
250 bp DNA Ladder Marker TAKARA公司，大连
氨苄青霉素 上海生工
EDTA、Tris、SDS
Gold ViewTM核酸染料
Agar Sigma公司
赛百盛
上海生工
2.1.1.3  主要试剂盒
UNI-10质粒小量抽提试剂盒：上海Sangon公司。
UNI-10 柱式 DNA凝胶回收试剂盒：上海Sangon公司。
UNI-10 柱式PCR产物纯化试剂盒：上海Sangon公司。
2.1.1.4  主要酶和缓冲液
试剂 购买公司
2.5 mmol/L dNTP Mixture TAKARA公司
DL-2000 DNA Ladder Marker 天根公司
Ex-Taq DNA Polymerase TAKARA公司
T4 DNA Ligase
rTaq DNA聚合酶 上海Sangon公司
TAKARA公司
2.1.1.5  xx培养基成分
试剂 购买公司
胰蛋白胨Tryptone OXOID公司
酵母抽提物Yeast extract OXOID公司
Agarose Amersco公司
氯化钠、碳酸氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、乙酸钠、氢氧化钠、柠檬酸二胺、Tris碱、甘氨酸、邻苯二胺、Tween-20购自上海生工生物工程有限公司，均为进口分装；其它试剂均为国产，分析纯。
2.1.2  试剂配制
2.1.2.1   氨苄青霉素（100mg/ml）
氨苄青霉素粉末用水配制成浓度为100 mg/ml的溶液，用0.22 μm滤器过滤xx，分装后-20°C保存。
2.1.2.2  LB培养基[33]
配制1升培养基，在950 ml去离子水中加入：
试剂 用量
胰化蛋白胨 10 g
酵母提取物 5 g
NaCl 10 g
摇动容器直至溶质溶解，用去离子水定容至1 L。在15 psi（1.05 kg/cm2）高压下蒸汽xx20 min。固体培养基在LB液体培养基xx前加入15 g/L的琼脂，在xx后冷却至50~60℃时加入xxx后铺板。
2.1.2.3  琼脂糖凝胶电泳缓冲液
1) 50×TAE：242 g Tris碱、57.1 ml冰乙酸溶解于650 ml超纯水中，加入200 ml的0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）后混匀，用超纯水定熔至1 L，无需xx。
2) 1×TAE：用50×TAE 50倍稀释，20 ml 50×TAE加水定容至1000 ml，作电极液及配胶时用，无需xx。
3) Gold ViewTM核酸染料（赛百盛），使用方法：每100ml琼脂糖溶液加3-5ul染液。
2.1.2.4  氯化钙溶液
用超纯水配500毫升10m mol/L氯化钙溶液，在15 psi（1.05 kg/cm2）高压下蒸汽xx20 min，4度保存。
2.1.2.5   0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）
在800 mL去离子中加入186.l g EDTA，剧烈搅拌使EDTAxx溶解，用NaOH调pH至8.0，定容至lL， 121℃高压xx备用。
2.1.2.6   1 mol/L Tris-HCl （pH 8.0）
80 ml 超纯水中溶解12.11 g Tris碱，用浓HCl调pH至8.0，加水定容至100 ml。
2.1.2.7  TE缓冲液（pH 8.0）
EDTA终浓度10 mmol/L：向95 ml超纯水中加入1 ml 1 mol/L Tris-HCl及0.2 ml 0.5 mol/L EDTA，调pH至8.0后加水定容至100 ml。

2.1.3  一些常用的分子生物学实验方法
2.1.3.1  质粒的小量提取（使用EZ-10 Spin Column Plasmid DNA Minipreps kit）
1) 取1.5-5.0 ml 在LB培养基中培养过夜的菌液，12,000×g离心2 min，弃尽上清；
2) 用100 μl 已加入RNase A 的solution I 悬浮xx沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块,放置1min；
3) 加入200 μl溶液 II，温和并充分地上下翻转混合4-6次均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液,放置1min。 注：此步骤不宜超过5 min； （注：菌量多的情况下，可酌情增加前三种溶液的用量。但溶液III和溶液 II的用量体积必须成比例。）
4) 加入350 μl溶液 III，温和并充分地上下翻转混合6-8次，大于12,000 ×g离心10 min；
5) 吸取步骤4中的离心上清并转移到DNA吸附柱（置于2 ml 收集管中），10,000 ×g离心2min；倒掉收集管中液体，将吸附柱放回收集管。
6) 注：EZ-10没有步骤6，但其他产家的产品大多会包括：在吸附柱中加入500ul 某液，离心30秒，除去操作中不可避免带入的少量蛋白质残留。倒掉收集管中的液体，将吸附管放回收集管；
7) 在吸附柱中加750 μlWash Buffer溶液，10000rpm离心2min， 弃滤液；以同样的方法再用700 μlWash Buffer洗涤一次，弃滤液；
8) 将吸附柱置回2 ml收集管中，12,000×g离心1 min，并可室温放置除尽乙醇；
9) 将吸附柱移入新的1.5 ml 离心管中，在DNA制备膜正中央加40-80μl Elution Buffer（25mM Tris）或等体积的ddH2O)，室温或50度左右水浴静置5 min。12,000×g离心1 min。管中的液体即为得到的DNA，-20℃保存。
2.1.3.2  琼脂糖凝胶电泳
1) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需要的1×TAE电泳缓冲液；
2) 在盛有TAE的三角瓶中加入1.0%~1.2%的琼脂糖粉，在微波炉中将悬浮液加热至琼脂糖xx溶解；
3) 制备检测用的小面积凝胶可倒胶液约20-30毫升于洁净烧杯中，温度冷至约50-60度后，加入1微升EB替代物，混匀。制备回收DNA片段用的凝胶，应适当增加胶液的体积。
4) 将凝胶模子装好后将琼脂糖溶液倒入其中，凝胶厚度视所需而定；
5) 待凝胶xx凝固后，小心地移去梳子，将凝胶放入电泳槽中，加入恰好没过胶面（约1 mm）的电泳缓冲液；
6) 将DNA样品与10×Loading Buffer以体积比9:1混合后，取适量的样品与5-10μl Marker分别加入对应加样孔中；
7) 盖上电泳槽，采用80-140V电压通电，使DNA向阳极移动；观察Loading Buffer中染料的迁移，染料的位置相当于300-400bp的DNA，当染料抵达凝胶中合适位置时，断开电源取出凝胶；
8) 将凝胶置于紫外凝胶成像系统中观察并保存电泳结果
2.1.3.3  从琼脂糖凝胶中回收DNA片段（使用EZ-10 Spin Column DNA Gel Extraction Kit ）
1) 在紫外灯下切下含有目的DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100 mg = 100 μl 体积）；
2) 按400微升每100毫克胶的比例加入Binding Buffer II，在50-60度的温水浴中孵育，10分钟，期间颠倒混匀，直至胶体xx溶解。对于高浓度胶（1.5%-2.0%）胶，可700微升每100毫克胶的比例加入Binding Buffer II
3) .吸取2 中的混合液，转移到EZ-10 column（置于2 ml 收集管）中，放置2分钟，10,000 ×g 离心2 min。弃滤液；
4) 将制备管置回离心管，加750ul  Wash solution，10,000×g 离心1min，弃滤液。以同样的方法再用750ul Wash solution，10,000×g 离心1min，弃滤液。（确认在Wash solution中已按试剂瓶上的指定体积加入无水乙醇），弃滤液；
5) 将制备管置于2 ml 收集管中，12,000×g 离心1 min；
6) 将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管中，在DNA 制备膜正中央加30-50μl Elution Buffer，室温静置2min。12,000×g 离心1 min 洗脱DNA。
2.1.3.4  大肠杆菌化学转化感受态细胞的制备 
1) 以无菌接种环取冻存的大肠杆菌菌种于LB平板划线，同时在含氨苄青霉素(Amp+)的LB培养基划线作为对照，37℃恒温箱培养过夜；
2) 第二天挑选生长良好的菌落加到5 ml LB液体培养基中，37℃剧烈振荡过夜；
3) 取100微升活化的培养液加到5 ml的LB培养基中，37℃剧烈振荡培养至对数中期，使OD600nm值达到0.4左右；
4) 在无菌条件下，将xx培养物分装入xx后冰上预冷的1.5毫升离心管中，冰浴10 min，4℃ 8,000 rpm 离心2 min，弃尽上清；
5) 再用200 微升每管的冰上预冷的0.1 mol/L的CaCl2 温和悬起xx沉淀，冰浴放置30 min，4℃ 5,000rpm 离心2 min后弃尽上清；
6) {zh1}以40微升冰预冷的 0.1 mol/L的CaCl2再次重悬沉淀，置冰上备用。如需保存，则需加入终浓度为15%的xx甘油，置于-70℃冰箱中保存备用。

2.1.4  含有HPV58基因组的质粒的扩增提取

1)取甘油保存的含HPV58基因基因组的菌液，划线培养于LB琼脂平板上，置于37℃培养箱培养16 h；
2)接种单个菌落于5ml LB 液体培养基中，置于37℃摇床180rpm过夜培养。
3)按2.1.3.1 质粒的小量提取方法提取。取2 μl用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.1.5  HPV58的L2基因PCR扩增 
2.1.5.1  引物的设计及载体构建策略
从Genebank中获取58型人乳头瘤病毒（HPV-58）基因组中的次要衣壳蛋白L2的DNA编码序列（如图2-1所示）。
 
     参考质粒pGEX-KGV和pET32a的多克隆位点，拟使用加端PCR（add-PCR）的方法将（Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓）这一肠激酶特异性切割位点的DNA编码序列添加到HPV-58 L2基因的5’-端上游，并分别在融合基因的5’-和3’-端添加核酸限制性内切酶NheI/ BglII和SacI/ XhoⅠ的特异性切割位点。最终的融合基因分别命名为NheI-ErkHPV58L2-SacI和BglII-ErkHPV58L2- XhoⅠ。
设计合成克隆NheI-ErkHPV58L2-SacI和BglII-ErkHPV58L2- XhoⅠ基因的2对引物，由英伟创津（Invetrogin）公司合成，用超纯水稀释至20 pmol/μl，分装后-20℃冻存备用。设计的引物序列如下所示：
(NheI-ErkHPV58L2-SacI)up: 5<CCGCTAGCTGACGACGACAAGATGAGACACAAACGGTC>3
       NheⅠ     EK位点           
(NheI-ErkHPV58L2-SacI)down: 5<TTGAGCTCCTAGGCCGCCACACGGA>3
                               SacI               
(BglII-ErkHPV58L2- XhoⅠ)up:
5< CCAGATCTGGACGACGACAAGATGAGACACAAACGGTC>3
BglⅡ      EK位点                  （正向引物）
(BglII-ErkHPV58L2- XhoⅠ)down:  5<TTCTCGAGCTAGGCCGCCACACGGA>3
                        XhoⅠ           （反向引物）
2.1.5.2  PCR反应体系和条件
PCR扩增反应：用含有HPV-58全基因组的质粒pHPV58作为基因扩增模板，分别以两对引物进行PCR扩增反应。

Ⅰ):PCR反应体系如下所示：
超纯水 28.8 μl
10×Ex-Taq Buffer(Mg2+ plus) 5.0 μl
2.5 mmol/L dNTP Mixture 4.0 μl
引物1：NheI-ErkHPV58L2-SacI up
 (or BglII-ErkHPV58L2- XhoⅠup)
5.0 μl
引物2：NheI-ErkHPV58L2-SacI down
 (or BglII-ErkHPV58L2- XhoⅠdown)
5.0 μl
模板：p HPV58-genome DNA 0.2 μl
Ex-Taq DNA Polymerase 2.0 μl
Total 50.0 μl

Ⅱ):PCR反应反应条件如下所示：
步骤 温度 时间
预变性 94℃ 4.0 min
变性
94℃ 60 s
退火 58℃ 45s
延伸 72℃ 2.0 min
30个循环（变性-延伸）  
延迟 72℃ 10.0 min

反应完成后取5μl做琼脂糖凝胶电泳，观察PCR结果，扩增出的片段长度与预期相符，则可以进行下一步的质粒构建。

2.2 重组质粒的构建
2.2.1  表达载体pET-32a（+）和pGEX-KGV
大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、目的基因表达水平高、培养周期短而且费用低、抗污染能力强、对许多蛋白具有很多耐受力等特点。考虑到表达的抗原为HPV58次要衣壳蛋白，分子量较大，要用于以后的单克隆抗体制备和检测，则需要其表达量高、容易纯化且能正确折叠，所以本实验选用pET32a(+)载体和pGEX-KGV对目的基因进行克隆表达。
pET-32a (+)质粒是pET-32系列的一个改良载体，包含T7启动子和乳糖操纵子，乳糖类似物IPTG通过lac阻抑蛋白的结合而诱导目的基因的表达。所有的pET32系列都有一个6个连续组氨酸组成的HIS Tag，组氨酸标签不仅有利于蛋白质的正确折叠，而且在以后的蛋白质纯化工作中可以利用该标签的特征使纯化工作更加简单。另外，pET32a(+)质粒上还具有肠激酶的酶切为点，在重组蛋白纯化出之后利用肠激酶位点的特性，用重组肠激酶酶切，可以获得去除融合标签的纯净的目标蛋白。

pGEX-KGV是基于pGEX-KG系列的一个本实验室自行改构的载体，与pET32a (+)一样，包含T7启动子和乳糖操纵子，乳糖类似物IPTG通过lac阻抑蛋白的结合而诱导目的基因的表达。与目的片段共表达的GST有利融合蛋白的正确折叠，因此可提高其可溶性表达，且在GST标签与目的蛋白中间插入了另一个片段生物标签StrepⅡ，融合蛋白在切去较大的GST标签后，能够使蛋白得到进一步的纯化，以便满足在后期实验中可能提出的更高要求。
2.2.2  重组质粒pET32aHPV58L2以及pGEX-KGVHPV58L2的设计
为了在E. coli中表达重组的HPV58的L2蛋白，我们构建了重组质粒pET-32aHPV58L2和pGEX-KGVHPV58L2。
它们分别构建于表达载体pET-32a和pGEX-KGV，其构建过程如下图2.2.2. (a)和2.2.2. (b) 所示。

图2.2.2(a)  重组质粒pGEX-KGV-HPV58L2的构建过程
Fig.2-2-2(a) Construction of expression vector pGEX-KGV-HPV58L2
 
 
 

图2.2.2(b)  重组质粒pET32a-HPV58L2的构建过程
Fig.2-2-2（b） Construction of expression vector pET32a-HPV58L2

  
2.2.2.3  pET-32a(+) 和 pGEX-KGV 质粒的扩增、抽提
采用UNI-10 柱式小量质粒抽提试剂盒提取质粒载体pGEX-KGV和pET-32a(+)，所得质粒分别溶于TE溶液中，用紫外-可见光分光光度计测OD260的吸收值，确定其浓度，-20度保存。
2.2.2.4  载体和PCR产物的酶切
本研究需构建两个质粒，过程分为A和B两部分：
（A）重组质粒pGEX-KGVHPV58L2的酶切体系如下所示：
载体pGEX-KGV/PCR产物（得自2.1.6.2） 30.0 μl
10×Buffer M 6.0 μl
NheI 3.0 μl
SacI  3.0 μl         
无菌水                                         18.0μl
Total 60.0 μl

（B）重组质粒pET32aHPV58L2的酶切体系如下所示：
载体pET32a/PCR产物（得自2.1.6.2） 30.0 μl
10×Buffer M 6.0 μl
BglⅡ 3.0 μl
XhoⅠ  3.0 μl         
无菌水                                         18.0μl
Total 60.0 μl
将反应体系置于37℃水浴中反应过夜，各取5 μl电泳，观察消化效果。
2.2.2.5  酶切片段的琼脂糖凝胶回收
1) 将剩下的所有酶切产物在一上样孔较大（~100 μl/孔）的琼脂糖凝胶中进行电泳；
2) 使用UNI-10 柱式DNA凝胶回收试剂盒，对经过双酶切后的载体和PCR扩增的基因片段进行回收，{zh1}分别用60 μl Elution Buffer洗脱两个酶切片段；
3) 各取3 μl进行电泳，观察回收结果。
由于双酶切下来的片段都较大，所以电泳图上较好分辨。根据图中酶切后的载体与PCR扩增片段各自的条带的亮度确定其质量比，最终确定连接时二者各自的加样量。
2.2.2.6  酶切片段的连接
将回收的pGEX-KGV/pET32a酶切片段和与其对应的HPV58的L2 PCR产物酶切片段xx尔比为1：1的比例混合进行连接。连接体系如下所示：

回收的pGEX-KGV/pET32a酶切片段 3.0 μl
回收的NheI-ErkHPV58L2-SacI/BglII-ErkHPV58L2- XhoⅠ酶切片段 5.0 μl
10× Ligation Buffer 1.0 μl
T4 DNA Ligase： 1.0 μl
Total 10.0 μl
将两个反应体系置于16℃水浴中连接16 h。（或4℃连接过夜）
2.2.2.7  连接产物的转化
1) 连接混合物10ul加入40 μl于冰上孵育数小时的E. coli DH5α感受态细胞中，轻轻混均，冰浴30 min；
2) 42℃热激90 s,马上取出至于冰浴中2 min；
3) 加入900ul LB培养基，37℃培养180 rpm振荡培养45min，使转化的xx恢复活性；
4) 5000 rpm离心5 min，弃上清750 μl，将xx重悬；
5) 将所有菌液涂于Amp+平板上，37℃培养过夜。
2.2.2.8  重组转化子的筛选与鉴定
1) 从转化的平板上随机挑取十余个生长良好的菌落，保种后分别接种至含100 μg/mL的氨苄青霉素 的5 ml LB培养基中， 37℃摇床上140rpm培养过夜；
2) 分别取1微升菌液做20微升的PCR体系，扩增HPV58的L2基因，核酸电泳检测。PCR体系如下：
10×PCR缓冲液 2μl
dNTP（2.5mmol/L） 1.6μl
primer-up 50pmol
primer-down 50pmol
模板(转化子单菌落/pGEX-KGV质粒) 少许
rTaq DNA聚合酶 0.13μl
dd H2O 补足至20 μl

PCR反应条件如下:
步骤 温度 时间
预变性 94℃ 4.0 min
变性 94℃ 60 s
退火 58℃ 45s
延伸 72℃ 2.0 min
30个循环（变性-延伸）  
延迟 72℃ 10.0 min
挑选能扩增约1400bp片段的PCR体系所对应的菌落数个，接种LB培养基各一支用作诱导鉴定和抽提质粒以便进行质粒大小判断和酶切鉴定。
3) 过夜培养的工程菌，用UNI-10质粒小量抽提试剂盒提取质粒，并各取3 μl进行电泳，初步判断大小正确的质粒；
4) 接种第三步中判断长度大概正确的质粒所对应的剩余菌液100微升至5ml的LB培养基中，37度震荡4小时，加入终浓度为1m M的IPTG诱导6小时，取1ml菌液5000rpm,5min收集沉淀，加入200微升loading buffer,在95度以上的水浴中煮5min，以BL-21为空白对照，SDS-PAGE检测在70kDa左右是否有丰度较高的蛋白质表达。
5) 酶切鉴定：取编号对应的既能有效扩增出L2基因，能够诱导表达出特异蛋白，且长度判断大致正确的几个质粒，按如下所示配置反应体系：
(注：A#= pGEX-KGV-HPV58L2 ，B#= pET-32a-HPV58L2)
(单位：μl) A# B#
质粒 4.0 4.0
10×Buffer 1.0 1.0
BglII
0 1
NheI 1 0
Sac I 1 0
XhoⅠ 0 1
ddH2O 补齐 补齐
Total 10.0 10.0
将反应体系置于37℃反应过夜，反应完成后全部上样进行电泳；

6) 序列鉴定：
将酶切鉴定为阳性的质粒待筛选、验证正确后，挑取阳性转化子接种于含氨苄青霉素的LB固体培养基上，平板划线，37℃倒置培养12~16h，挑取单菌落，液体培养，制备甘油管，送英伟创津（invitrogen）公司进行DNA序列测定。测序反应引物为通用引物pGEX_3_primer和T7/T7 TER，前后各测一个反应。
7) 工程菌的保存：
测序确证的阳性重组子甘油管液体1000μl，-70℃标记保存，作为保藏菌种。分别标记为BL21/ pGEX-KGV-HPV58L2和BL21/ pET-32a -HPV58L2
2.3  实验结果
2.3.1  HPV58 L2基因的PCR扩增
通过PCR，我们成功的得到了带有两种不同粘性末端的大小约为1400bp的条带，与HPV58L2基因的大小相当（图2.1）：
 
1.DL-2000 ladder Marker； 2： 用NheI-ErkHPV58L2-SacI引物扩增出的HPV58L2基因 
3：用BglII-ErkHPV58L2- XhoⅠ引物扩增出的HPV58L2基因
2.3.2重组质粒的鉴定
酶切后的片段进行连接后，用氯化钙法转化的方法转入E. coli DH5α感受态细胞。经过转化实验，在含有氨苄青霉素的LB平板上得到了由重组质粒转化而成的菌落BL21/ pGEX-KGV-HPV58L2和BL21/ pET-32a -HPV58L2。
分别挑选数枚菌落进行菌落PCR筛选、诱导筛选、质粒长度判断和酶切鉴定，结果如图2.2（A、B、C、D）所示。

  
图（A）pGEX-KGV-HPV58L2菌落PCR筛选部分     图（C）pET32a-HPV58L2 菌落PCR筛选
 
图（B）pGEX-KGV-HPV58L2酶切检测
1，marker;  2，菌落PCR1;  3，菌落PCR2； 4，pGEX-KGV原始质粒；
5，pGEX-KGV原始质粒双酶切；6，pGEX-KGV-HPV58L2质粒；7 pGEX-KGV-HPV58L2质粒双酶切
 
图（D）pET32a-HPV58L2酶切检测
1，marker;  2，菌落PCR1;  3，菌落PCR2； 4，pET-32a原始质粒；
5，pET-32a原始质粒双酶切；6，pET32a-HPV58L2质粒；7 pET32a-HPV58L2质粒双酶切
图2.2重组质粒的PCR和双酶切筛选鉴定
琼脂糖电泳结果（A图和C图）表明：所选菌落中绝大部分被插入了HPV58L2基因。
在经过进一步的诱导鉴定后，在两种重组的菌群中分别选择其中较有把握的一个质粒进行酶切鉴定，如图（B、D）所示，对比第四和第六道，可以看出，筛选出的质粒要比原始质粒pGEX-KGV/pET32a略大。双酶切后，前者在1400bp左右得出一条带，与第二三道的PCR所得条带所在的位置几乎一致。
基因测序结果如附图。
确定其阅读框正确后，将pET32a-HPV58L2和pGEX-KGV-HPV58L2分别表达的目的蛋白简称为Trx-HPV58L2、GST-STrepⅡ-HPV58L2（以下简写GS-HPV58L2）.
 

2.4讨论
本研究构建的两个原核表达质粒是基于有利于可溶性融合蛋白表达纯化的pGEX-KGV和pET32a两个载体，设计的初衷在于：
1） 期望大量获得HPV58L2的可溶性融合蛋白，因为可溶性融合蛋白的空间结构理论上说更接近HPV58L2的xx构象，所以以其为基础所制备筛选出的单克隆抗体可能获得更高的活性，以及除线性表位外，或许还可能针对HPV58L2的空间表位；
2） 两种不同的表达载体给予两个融合蛋白不同的标签和不同的纯化方案，互为备用，且可灵活应用于杂交瘤细胞的筛选和单克隆抗体的检测；
3） pGEX-KGV-HPV58L2重组载体中，在GST和凝血酶位点后巧妙地加入了小标签STrepⅡ和肠激酶EK酶切位点，前者可以为融合蛋白的分离纯化提供另外一个纯化方案，即STreptrap亲和层析：由于GST分子量较大，在为获得更接近HPV58L2xx构象蛋白的情况下，用凝血酶thrombin处理切去GST后，STrepⅡ极易暴露，用亲和层析纯化可能获得较好的效果，但是其中，STreptrap亲和层析所用试剂的经济考量也很必须，此外EK酶切位点是可根据实际需要，用来进一步切除标签STrepⅡ；
4） pET32a- HPV58L2重组载体中，HIS Tag 位于Trx 和S Tag-HPV58L2之间，在可溶性表达中，很可能会被折叠入蛋白的内部，在这种情况下，可以考虑做包涵体的纯化。
 

第三章GS58L2和TRX58L2的表达、提取、分离纯化和性质鉴定
3.1实验材料与方法
3.1.1实验材料
工程菌菌种BL21/pET32a-HPV58L2、BL21/ pGEX-KGV-HPV58L2菌种由本实验室构建和保存。

3.1.1.1主要试剂
试剂名称 购买公司
Tris
D-lactose Sangon公司
Sangon
NaCl Sigma USA分装
EDTA Sigma USA
蛋白质marker PageRulerTM Prestained Protein Ladder Fermentas公司
Egg lysozyme 上海生工
重组肠激酶 Merck公司
氨苄青霉素 上海生工
蛋白质浓度测定试剂盒（BCA法）
GST-一抗
HIS-一抗
偶联HRP-羊抗鼠二抗 Pierce公司
碧云天公司
广州维嘉
云大生物
3.1.1.2  xx培养基成分
试剂 购买公司
Tryptone OXOID公司
Yeast extract OXOID公司
Agarose 上海Sangon公司
其它试剂均为国产分析纯。
3.1.1.3  实验设备
设备名称 购买公司
CO2培养箱 Thermo Fisher公司
低温冰箱，SANYO-MDF-U50VC SANYO公司
超净工作台，HF safe-1200 Forma公司
Milli-Q超纯水系统 Millipore公司
高速冷冻离心机，Avanti J-25 Beckman公司
pH计 Orion公司
自动高压xx装置，HV-110 HIRAYAMA公司
电子天平，BP211D Sartorius公司
快速恒温数显水箱，HH-42型 常州电器国华有限公司
隔水式恒温电热培养箱，PYX-DHS-40×50-BS 上海跃进医疗器械厂
恒温振荡器，ZD-85 常州电器国华有限公司
水浴振荡器，HZS-H型 东联电子技术有限公司
蛋白质电泳仪 GE Health公司
半干电转仪 GE Health公司
蛋白质分离纯化系统，?KTA Explorer 100 GE Health公司
层析柱 Millipore公司
分光光度计 Beckman公司

3.1.2  试剂配制
3.1.2.1  磷酸缓冲盐溶液（PBS）
试剂 终浓度
NaCl 137 mmol/L
KCl 2.7 mmol/L
Na2HPO4 10 mmol/L
KH2PO4 2 mmol/L
 高压下蒸汽xx20 min，室温保存。
3.1.2.2   SDS-PAGE和Western Blot试剂
1） 30%丙烯酰胺混合液（100mL）
试剂 用量
丙烯酰胺 29g
N,N'-亚甲双丙烯酰胺 1g
向烧杯中加入约60 ml的去离子水，充分搅拌使其溶解。待xx溶解后加去离子水将溶液定容至100ml，用0.45 mm滤膜滤去杂质。避光4℃保存。
2）  1.5mol/L Tris pH8.8 （1L）
称量181.7 g Tris置于烧杯中,加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解,加入浓盐酸，调节pH至8.8, {zh1}用去离子水定容至1L。4度保存。
3）  1.0mol/L Tris pH6.8（1L）
    称量121.1 g Tris置于烧杯中,加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解,加入浓盐酸，调节pH至6.8，{zh1}用去离子水定容至1L。4度保存。
4）  10%SDS（100mL）
   称量10gSDS置于烧杯中,加入约80 ml的去离子水，充分搅拌溶解, 加入浓盐酸，调节pH至6.8,{zh1}用去离子水定容至100ml。室温保存。在使用时须确定SDS没有因为低温而析出。
5）  10%过硫酸铵（1mL）
    称取1.5g过硫酸铵加入15ml取离子水充分溶解分装，于棕色瓶中-20度或者4℃保存。理论上说，过硫酸铵溶液在4℃下可储存2周左右，超过期限会失去催化作用。
6）  5×SDS-PAGE电泳缓冲液（1L）
试剂 用量
Tris 15.1g
Glycine 94g
SDS 5.0g
    称量上述试剂，置于1 L烧杯中，加入约800 ml的去离子水，搅拌溶解，加入去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。在使用时用去离子水将其稀释5倍，即是1×工作液。
7）  5×SDS-PAGE Loading Buffer（5mL）
试剂 用量
1M Tris-HCl(PH=6.8) 1.25ml
SDS 0.5g
溴酚蓝 25mg
甘油 2.5ml
2-ME 0.25 ml
    量取上述试剂，置于10 ml塑料离心管中，加去离子水溶解后定容至5 ml，室温保存，甘油适当加量可使蛋白样在上样时沉降得更好。加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。
8） 考马斯亮蓝R-250染色液（1L）
试剂 用量
考马斯亮蓝R-250 1g
甲醇 250ml
冰醋酸 100ml
    加入蒸馏水搅拌溶解，定容至1L，滤纸除去颗粒物质后，室温保存。
9） 考马斯亮蓝R-250脱色液（1L）
试剂 用量
醋酸 100ml
甲醇 50ml
去离子水 850ml
    充分混合后使用。
10） 转膜缓冲液 （湿转）（1L）
试剂 用量
Gly 2.9g
Tris 5.8g
SDS 0.4g（酌量）
甲醇 200ml
    加入蒸馏水定容到1L。
11）转膜缓冲液 （半干转转）（100ml）
试剂 用量
Gly 1.44g
Tris 0.3g
SDS 酌量
甲醇 20ml
加入蒸馏水定容到100ml。
SDS可视目的蛋白分子量而定是否加入以及量的多少，SDS可提高电转的效率，一般电转分子量比较小的目的蛋白可不加SDS。
12）TBS (10*):   1L     
试剂 用量
NaCl 88g
Tris 12.12g
H2O 750ml
      用HCl调PH至8.0，再用纯水定容，用时稀释。
3.1.2.3  蛋白纯化试剂
1）包涵体裂解液Ⅰ
试剂 浓度/用量
Tris-Cl (pH8.0) 50mmol/L
NaCl 500mmol/L
DTT
甘油
EDTA
β巯基乙醇
Triton-X100
溶菌酶 1mmol/L
5%
1mmol/L
5mmol/L
0.5%
800μg/10ml

2）包涵体裂解液Ⅱ
试剂 浓度/用量
Tris-Cl (pH8.0) 50mmol/L
NaCl 150mmol/L
EDTA
β巯基乙醇
尿素 1mmol/L
5mmol/L
1 mol/L
 
3）包涵体裂解液Ⅲ
试剂 浓度/用量
Tris-Cl (pH8.5) 50mmol/L
NaCl 150mmol/L
EDTA
β巯基乙醇
尿素 1mmol/L
5mmol/L
8mol/L

注：1 mmol/L EDTA（用于(His)6-Trx-HPV58L2包涵体复性的不加）； 因为溶液中要添加8M尿素，尿素体积极大，所以在配置溶液时加水时应慎重； 尿素溶解吸热，为加速溶解，可适当温水浴。
4）包涵体复性液Ⅰ
试剂 浓度/用量
Tris-Cl (pH8.0) 25mmol/L
NaCl 150mmol/L
EDTA
β巯基乙醇
尿素
甘油
L-Arg
PEG8000
GSH
GSSG 1mmol/L
5mmol/L
4mol/L
5%
50mmol/L
0.1%
10mmol/L
1mmol/L

5）包涵体复性液Ⅱ
试剂 浓度/用量
Tris-Cl (pH8.0) 25mmol/L
NaCl 150mmol/L
EDTA
β巯基乙醇
尿素
甘油
L-Arg
PEG8000
GSH
GSSG 1mmol/L
5mmol/L
2mol/L
5%
50mmol/L
0.1%
10mmol/L
1mmol/L

6）包涵体复性液Ⅲ
试剂 浓度/用量
Tris-Cl (pH8.0) 25mmol/L
NaCl 150mmol/L
EDTA
β巯基乙醇
尿素
甘油
L-Arg
PEG8000
GSH
GSSG 1mmol/L
5mmol/L
1mol/L
5%
50mmol/L
0.1%
10mmol/L
1mmol/L

7）包涵体复性液Ⅳ
试剂 浓度/用量
Tris-Cl (pH8.0) 25mmol/L
NaCl 150mmol/L
EDTA
β巯基乙醇
甘油
L-Arg
PEG8000
GSH
GSSG 1mmol/L
5mmol/L
5%
50mmol/L
0.1%
10mmol/L
1mmol/L
复性过程中可能使用到的的添加剂及其作用：
    1）共溶剂：如PEG6000-20000，资料上说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用，本实验的使用浓度在0.1%左右。
    2）二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。
    3）分子伴侣，即热休克蛋白（HSP），是一种没有蛋白质特异性的促进折叠的蛋白因子，研究发现很多蛋白在缺乏分子伴侣时无法自己正确的折叠。有人构建了与伴侣分子共同表达的菌株，据说效果不错。不过在生产中还没有看到2和3的应用的例子。
    4）0.4-0.6ML-Arg：成功的应用于很多蛋白如t-PA的复性中，可以抑制二聚体的形成。
    5）甘油等：增加黏度，减少分子碰撞机会，一般使用浓度在5%-30%左右。
    6）一定的盐浓度，可能是为了降低某些带电集团间的斥力，有利于蛋白质的折叠。
    7）辅助因子：添加蛋白质活性状态必须的辅助因子如辅酶辅基等或蛋白配体等很多时候对蛋白质正确的折叠是有利的。

    复性时经常发生蛋白析出的现象，其中的原因可能是没有注意到复性时的蛋白浓度。一般推荐使用的浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。
    复性效果的检测方法有很多，根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。
1、凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和xx状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。
2、光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。
3、色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。
4、生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能xx反映体内活性。
5、黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。
6、免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。
    因为GST的复性效果从某种程度上可以指示出目的蛋白的折叠情况，所以本实验用GSTrap的亲和层析法检测蛋白质的复性效率。

3.3.1 BL21/pET32a-HPV58L2的包涵体Trx-HPV58L2的表达纯化

 3.3.1.1 包涵体-Trx-HPV58L2的表达、洗涤和溶解
I）离心收集5.8mM的D-lactose37度诱导8-10小时的BL21/pET32a-HPV58L2湿菌加入包涵体裂解液Ⅰ（按50ml裂解液/10g菌计算）并重悬菌液至均匀，用三角瓶盛放，置37度摇床震荡过夜。
II）12000rpm,4度条件下,离心30min，离心弃上清，
III）于沉淀中加入包涵体裂解液Ⅱ（按约20ml裂解液/g沉淀计算），磁力混匀后再室温搅拌30min，12000rpm,4度，30min，离心弃上清，重复此步骤一次；
IV）于沉淀中加入与上步骤中等体积的ddH20，磁力搅拌至均匀，12000rpm,4度，30min，离心弃上清，重复此步骤一次；
V）于沉淀中加入与适量的包涵体裂解液Ⅲ（不含EDTA），磁力搅拌至xx溶解，12000rpm,4度，30min，离心取上清，即为变性的包涵体溶液。

3.3.1.2 变性包涵体Trx-HPV58L2的HISTrap亲和层析
I）按照一般步骤准备好ATATA纯化系统，变性包涵体HISTrap的结合缓冲液平衡预装柱，再用变性包涵体HISTrap的结合缓冲液充满整个进样柱并从进样柱下方推入溶解的包涵体溶液，上样5-10ml，收集穿透液；
II）按照3%，10%，20%，50%，{bfb}B液梯度洗脱并收集各峰所对应的溶液；
III）分别做样并电泳；
IV）电泳结果分析纯化效果
3.3.1.3包涵体-Trx-HPV58L2的复性
I）用包涵体复性液Ⅰ将10%梯度洗脱的蛋白质溶液稀释5倍，4度条件下，以20:1的外液内液体积比，透析（用分子量为50kD的免煮透析膜）4-8小时；
II）换与上步骤等外液体积的包涵体复性液Ⅱ，4度条件下，透析8小时以上；
III）换与上步骤等外液体积的包涵体复性液Ⅲ，4度条件下，，透析4-8小时；
IV）换与上步骤等外液体积的包涵体复性液Ⅳ，4度条件下，并重复此步骤2次。

3.3.2 BL21/pGEX-KGV-HPV58L2菌的包涵体GS-HPV58L2纯化流程
3.3.2.1 包涵体GS-HPV58L2的洗涤和溶解
I）离心收集5.8mM的D-lactose37度诱导8-10小时的湿菌加入包涵体裂解液Ⅰ（按50ml裂解液/10g菌计算）并重悬菌液至均匀，，用三角瓶盛放，置37度摇床震荡过夜。
II）12000rpm,4度，30min，离心弃上清，
III）于沉淀中加入包涵体裂解液Ⅱ（按约20ml裂解液/g沉淀计算），磁力搅拌至均匀，12000rpm,4度，30min，离心弃上清，重复此步骤一次；
IV）于沉淀中加入与上步骤中等体积的ddH20，磁力搅拌至均匀，12000rpm,4度，30min，离心弃上清，重复此步骤一次；
V）于沉淀中加入与适量的包涵体裂解液Ⅲ，磁力搅拌至xx溶解，12000rpm,4度，30min，离心取上清，即为变性的包涵体溶液
3.3.2.2 包涵体GS-HPV58L2的复性和GSTrap亲和层析
I）用包涵体复性液Ⅰ将变性的包涵体溶液稀释5倍，4度条件下，以20:1的外液、内液体积比，透析（用分子量为50kD的免煮透析膜）4-8小时；
II）换与上步骤等外液体积的包涵体复性液Ⅱ，4度条件下，透析8小时以上；
III）换与上步骤等外液体积的包涵体复性液Ⅲ，4度条件下，，透析4-8小时；
IV）换与上步骤等外液体积的包涵体复性液Ⅳ，4度条件下，并重复此步骤2次。
V）按照以下步骤纯化复性好的包涵体：
预装柱的处理
A. 打开AKATA系统以及相连计算机
B. 打开相关操作程序和界面，调flow=1ml/min；
C. 旋开预装柱的上下塞，先装预装柱的地步与柱座，再用1ml/min的20%乙醇已点滴形式将上接口处的空气排出，连接好管道；
D. 填5-10倍柱体积去离子H2O洗预装柱至基线平稳 
向上述复性蛋白推入AKATA进样柱中，经过水洗，binding buffer结合稳定GSTrap（5ml）预装柱后，进样20到25毫升，binding buffer洗涤至OD280吸收峰回到基线附近，再用{bfb}的elution buffer洗脱，每支2毫升分管收集洗脱样，SDS-PAGE检测上述各个阶段的样。