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免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)
[转贴 2010-06-19 05:25:39]
免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于
研究
蛋白
质相互作用的经典方法。是确定两种
蛋白质
在完整
细胞
内生理性相互作用的有效方法。其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。
其优点为:(1)相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于xx状态;(2)蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响;(3)可以分离得到xx状态的相互作用蛋白复合物。缺点为:(1)可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;(2)两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;(3)必须在
实验
前预测目的蛋白是什么,以选择{zh1}检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。
实验流程为:
(1)转染后24-48 h 可收获细胞,加入适量细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂),冰上裂解30min, 细胞裂解液于4°C, {zd0}转速离心30 min后取上清;
(2)取少量裂解液以备Western blot分析,剩余裂解液加1μg相应的抗体加入到细胞裂解液,4°C缓慢摇晃孵育过夜;
(3)取10μl protein A 琼脂糖珠,用适量裂解缓冲液洗3 次,每次3,000 rpm离心3 min;
(4)将预处理过的10μl protein A 琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中4°C缓慢摇晃孵育2-4h,使抗体与protein A琼脂糖珠偶连;
(5)免疫沉淀反应后,在4°C 以3,000 rpm 速度离心3 min,将琼脂糖珠离心至管底;将上清小心吸去,琼脂糖珠用1ml裂解缓冲液洗3-4次;{zh1}加入15μl的2×SDS 上样缓冲液,沸水煮5分钟;
(6)SDS-PAGE, Western blotting或质谱仪分析。
注意的问题:
(1)细胞裂解采用温和的裂解条件,不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用,多采用非离子变性剂(NP40或Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的,通过经验确定。不能用高浓度的变性剂(0.2%SDS),细胞裂解液中要加各种酶抑制剂,如商品化的 cocktailer。
(2)使用明确的抗体,可以将几种抗体共同使用
(3)使用对照抗体:
单克隆抗体:正常小鼠的IgG或另一类单抗
兔多克隆抗体:正常兔IgG
在免疫共沉淀实验中要保证实验结果的真实性,应注意以下几点:
(1) 确保共沉淀的蛋白是由所加入的抗体沉淀得到的,而并非外源非特异蛋白,单克隆抗体的使用有助于避免污染的发生;
(2) 要确保抗体的特异性,即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀;
(3) 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中,而不是由于细胞的溶解才发生的,这需要进行蛋白质的定位来确定。
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