Northern杂交用于分析RNA;
Southern杂交用于分析DNA;
Western杂交用于分析蛋白质。
Sorthern 杂交
将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
northern印迹杂交
Northern印迹杂交(Northern blot)。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建,称为Southern印迹技术,RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。Northern 印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似,只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性,而不用NaOH,因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合,它同样可在高盐中进行转印,但在烘烤前与膜结合得并不牢固,所以在转印后用低盐缓冲液洗脱,否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB,因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小,可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳,之后将标记物切下、上色、照相,样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml
EB的0.1mol/L醋酸铵中10min,光在水中就可脱色,在紫外光下用一次成像相机拍照时,上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光,若接触太多或在白炽灯下暴露过久,会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时,甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂,但是有毒,因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。
RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法。
<1>试剂:
10×MSE缓冲液:0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS),pH7.0,50mmol/L醋酸钠,1mmol/L EDTA pH8.0。
5×载样缓冲液:50%甘油,1mmol/L EDTA,0.4%溴酚蓝。
甲醛:用水配成37%浓度(12.3mol/L),应在通风柜中操作,pH高于4.0。
20×SSC;
去离子甲酰胺;
50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl);
0.1mol/L Tris,pH7.5。
<2>步骤:
[1]40ml水中加7g琼脂糖,煮沸溶解,冷却到60℃,加7ml10×MSE缓冲液,11.5ml
甲醛,加水定容至70ml,混匀后倒入盛胶槽。
[2]等胶凝固后,去掉梳子和胶布,将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。
[3]使RNA变性(最多20μg),RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml,甲醛3.5ml,去离子甲酰胺10ml。
[4]55℃加热15min,冰浴冷却。
[5]加2ml5×载样缓冲液。
[6]上样、同时加RNA标记物(同位素(32P)dCTP)。
[7]60伏电泳过夜。
[8]取出凝胶,水中浸泡2次,每次5min。
[9]室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min,水解高分子RNA,以增强转印。
[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。
[11]20×SSC洗胶1h。
[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。
[13]取出硝酸纤维素膜,80℃真空烘烤2h。
Western杂交
Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
其原理是:生物中含有一定量的目的蛋白。先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白,将蛋白质样品溶解于含有去污剂和还原剂的溶液中,经SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离,再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上,接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭其非特异性位点。然后加入特异抗性体(一抗),膜上的目的蛋白(抗原)与一抗结合后,再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗(通常一抗用兔来源的抗体时,二抗常用羊抗兔免疫球蛋白抗体),{zh1}通过二抗上带标记化合物(一般为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)的特异性反应进行检测。根据检测结果,从而可得知被检生物(植物)细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
Western杂交方法灵敏度高,通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白。 |