反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析极大多数的 非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的固定相本质上都是疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作用的大小程度来 分离的，样品基体中其它疏水杂质组分也能以同样的方式保留。

除C18、C8、C4、C2、C1、CN、NH2和Phenyl等常见的一些 键合硅胶固定相外，还有几个分支品种，如混合相固定相（例如苯基－己基）、封尾和未封尾的填料种类以及极性嵌入固定相等。还有其它很多填料也用于反相色 谱，包括聚合物、聚合物包覆硅胶和聚合物包覆氧化铝、无机－有机杂化物、涂覆氧化锆和石墨化碳等。不同的固定相分别都有自己的优点和缺点。

反 相色谱柱通过调节流动相组成的变化和添加一些试剂的方式，成功实现了许许多多不同的色谱应用。一些技术是利用添加剂改变了填料的表面特性，有时候这些添加 剂本身有可能会污染硅胶和键合相表面。

硅 胶表面除了有疏水键合相外，还有别的一些化学特性。残留的硅醇基存在于所有的硅胶键合填料中。这些硅醇基具有弱酸性，因此能与某些待分析物和样品基体中的 杂质相互作用，特别是与碱性物质发生作用。因为硅醇基的pKa值大约是4.5，离子化能在中性pH条件下发生，而存在与阳离子产生静电相互作用的可能。较 老的A型硅胶含有高浓度金属杂质离子（有时候达100ppm或更多），而这能使硅胶表面的酸性更大，甚至能与某些金属鳌合化合物发生作用。残留硅醇基在非 末封尾的键合硅胶表面和在C2或C4等短链硅胶键合相填料中，麻烦更大。

必须清楚地了解所用固定相的表面特性和可能存在的分析物－固定相 表面的相互作用模式，这样当用反相色谱方法时才能充分考虑到潜在的样品基质污染的影响。例如， 疏水性非常强的样品基质如玉米油、高芳香物质和蜡能粘在反相填料的表面并且改变表面性质。含有类蛋白质物质的生物质样品也能吸附在填料表面。尽管分析者想 尽{zd0}努力来保护HPLC柱子免受外源物质的污染，但某些分析物－样品基体的结合作用最终会使固定相受到污染。

当柱子被污染，它的色谱行 为和没被污染的柱子会有些不同。被污染的反相色谱柱会产生反压问题，必须进行清洗和再生才能恢复到原来或接近原来的状态，本文将提出了一些切实可行的恢复 方案供大家讨论或参考。着重点在最常用的键合硅胶柱上，其它类型的反相柱的清洁和再生步骤{zh1}也有介绍。


什么原因导致污染 物在反相柱上的聚集？


通常，样品基体中会含有一些对分析者来说不感兴趣的东西，如盐、脂类、含脂物质、腐殖酸、疏水蛋白 质和其它一些生物质，是一些可能与HPLC柱发生相互作用的物质。这些物质和目标分析物比，保留能力有些强，有些弱。那些保留能力小的杂质，如盐类，通常 在死体积处就会被洗脱出来，在谱图上表现为干扰峰、小斑点、基线扰动、甚至是倒峰等等。而样品基体中的强保留物质，如果流动相的洗脱能力从来没有调高到足 以把它们洗脱出来，多次上样后，它们就会在柱头累积。这种现象通常在等度洗脱时容易观察到。保留能力中等的杂质能被缓慢洗出而且表现为 宽峰、基线扰动或者基线漂移。
有时，这些被吸附的杂质累积到杂质本身足以作为一种新固定相的程度。分析物能与这些杂质作用，起一定的分离作用。此 时保留时间会发生漂移，并出现峰形拖尾。如果污染程度再严重下去，柱子的反压能超过泵所能承受的{zd0}压力，依照发生堵塞的位置不同，可使柱子无法工作或使 柱头塌陷产生空洞。


硅胶基质键合反相柱的清洗


再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物 的性质并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的清洗步骤来除去这些污染物往往就能恢复其色谱性能。


经 过等度运行后的色谱柱，有时用90～100％含量的溶剂B（双溶剂反相系统中洗脱能力较强的溶剂，如甲醇、乙晴、四氢 呋喃等）冲洗20个柱体积可以xx污染物（色谱柱的柱体积和空柱管体积概念不同，一根4.6x250mm柱子的柱体积只有2.5ml，4.6x150mm 是1.5ml,2.1x150mm是0.28ml,4.6x50mm是0.5ml,3.0x150mm是0.64ml）。


如果使 用的是缓冲盐系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲盐沉淀，这样会导致更大的问题，如柱头筛板堵塞、连 接管路堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲盐流动相（即把缓冲液换成水），冲洗5～10个柱体积以后才切换到用强溶剂清洗。


有 时候，强溶剂B也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么就需要用更强的溶剂或者是系列溶剂组合。如果污染物不是生物质的，一种强溶剂或几种溶剂组合清洗 基本能解决问题。柱子生产厂家的网页和产品说明书上很多也有清洗方法推荐。


所有的清洗方法的模式普遍都类似，溶剂系列中所用溶剂 的强度逐级增加，{zh1}一个溶剂往往是非极性（疏水性）很强的（如醋酸乙酯甚至是烷烃），以便于溶解脂质、油类等非极性污染物。溶剂系列中每个溶剂都保证能 与下一个溶剂互溶。整个清洗过程结束后，在回到原来的流动相体系前，必须借助一个中等强度的互溶性非常好的溶剂过渡。例如， 异丙醇是一个非常好的过渡溶剂，它既能与正己烷或二氯甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。还有，如果 使用紫外检测器，须避免选用在紫外区域有吸收的溶剂，要不然需使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。


对于典型的硅胶基质键合反相 柱，在未使用缓冲溶液的条件下，推荐使用以下清洗溶剂系列：
100％甲醇---100％乙晴---75％乙晴/25％异丙醇---100％异丙醇---100％二氯甲烷---100％正己烷
用每种溶剂冲 洗至少10个柱体积，对于250mm×4.6mm的分析柱，合适的冲洗流速是1～2ml/min。{zh1}用10柱体积的异丙醇过渡，然后回到原来的流动相体 系（但不含缓冲盐），{zh1}回复到起始流动相配置。四氢呋喃也是另外一种常用的清洗溶剂。如果怀疑柱子被严重污染，还可用二甲亚砜（DMSO）或 二甲基甲酰铵和水按50：50的比例混合，以低于0.5ml/min的流速冲洗色谱柱。


成功再生反相柱子是一个非常耗时的过程， 溶剂冲洗序列可以编成一个梯度洗脱的程序自动进行，以方便过夜操作。


还有一个老问题就是冲洗再生色谱柱是正冲还是反冲。污染物是 在柱子入口端聚积，反向冲洗当然是把污染物洗出柱子最方便的。现在的色谱柱，高压填充的柱床很稳定，无须担心反冲会冲坏柱子的问题。但如果碰到厂家在入口 端使用孔径相对较大筛板的情况，就不能反冲。另外冲洗柱子时通常不连接检测器。柱子冲洗频率取决于有多少污染物通过进样带到柱子里了，一般反相柱，在分离 度xx丧失或者洗脱出不相关的物质峰之前，还是能承受相当程度的污染的，很多人倾向于等到有上述异常现象出现后，再进行清洗柱子，这样做，污染物累积程度 高了，清洗起来也困难得多。所以，如你的反相柱经常进样很脏的样品，建议你定期做个清洗。清洗次数越多，每次清洗越容易。