反相色谱分离原理及适用对象

反相色谱是依据因溶质疏水性的不同而产生的溶质在流动相与固定相之间分配系数的差异而分离的。它主要适用于分析大多数的有机化合物，如多肽、蛋白质、核 酸、糖缀合物。样品一般应溶于水相体系中在反相色谱中使用的柱填料主要是键合相硅胶，含有不同的有机覆盖层，如烷基(C18、C8)、苯基、氰基等。

反相柱子污染的产生

通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的物质。盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能在使用时与HPLC柱发生相互作 用的物质。这些物质有比分析者的目标物或小或大的保留值。那些保留值较
小的物质和盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱柱。这些非目标产物的干扰能 被检测器检测到而且能形成色谱峰、气泡、基线漂移或者负峰。如果样品成分在柱子中有很强的保留，而且流动相溶液成分不足以把这些物质洗脱下来，多次进
样 后，这些物质通常就会积累在柱头，污染色谱柱。

当柱子被污染，它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。被污染的柱子会产生反压(污染严重时，柱子的反压能超出输液泵所能承受的{zd0}压力)、峰形变坏 (拖尾、分叉等)、保留时间改变，使色谱柱无法正常工作。

反相色谱柱的清洁和再生

被污染的色谱柱必须清洗和再生才有可能改善柱子的性能。再生被污染的Ⅲ c柱子的关键是知道污染物的性质，并且能找到适当的溶剂来去除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除去这些污染物往往能 恢复其色谱行为。有时候，经过多次进样以后的色谱柱用90～100％的较强的溶剂冲洗20个柱体积可以xx污染物。柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲 醇、乙腈、四氢呋喃。如果你使用的是缓冲溶液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度的有机溶剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲溶液沉淀，这样会 导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄露、柱塞损伤或进样阀转轴失灵等。应该先用无缓冲流动相(即把缓冲溶剂换成水)冲洗5～10个柱体积以后才更换 强溶剂。

有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉，压力仍没下降，将色谱柱反方向连接，用0．5ml／min的流速冲洗1小时，若柱压仍高，则色谱柱内 置过滤器被堵塞，应冲洗或更换。但柱连接端的拆卸或重装会导致柱效下降(有效塔板数下降和不对称峰)：若色谱柱的柱头填料发生污染，柱子将不能被彻底恢 复，只能通过去掉进口端的部分填料(2-5mm)，重新填充，进行有效的柱效恢复。

一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互溶。清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互溶的溶 剂而回到原始溶剂系统。例如，异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的
溶剂，因为它能与正己烷或二氯甲烷互溶，又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非 常大，必须确保较低的流速以免使泵压过高。当然，如果使用紫外检测器时，应避免溶剂在紫外区有吸收，否则需要使用大量的溶剂冲洗才能使基线平稳。

对于典型的硅胶键合柱来说，如果没有缓冲溶液，此时用不同极性的一系列溶剂冲洗有可能解决问题。如分别用100％甲醇、100％乙腈、75％乙腈一 25％异丙醇、100％异丙醇、100％~-氯甲烷、100％正己烷依次冲洗。用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相溶性，柱子必须用异丙醇冲洗后，才能用 原来的水相溶剂。每种溶剂至少冲洗10个柱体积。成功再生反相柱子是一个非常耗时间的过程。

色谱柱是液相色谱系统获得分离的中心部件，许多分离问题都归结于色谱柱。柱故障主要是机械、色谱或者化学方面的原因引起的，维护色谱柱和排除故障，需要懂 得液相色谱的分离过程以及色谱柱本身的构造是非常重要的。色谱柱的价格昂贵，应避免人为地损坏，并尽可能延长其寿命。