【摘要】 　　目的 应用反相高效液相色谱法测定单体绿原酸的含量。方法 流动相：0.1％甲酸-乙腈（92:8）（pH 2.6），色谱柱：C18（250×4.6 mm,5 μm），测定波长：323 nm。结果 绿原酸在2.50 μg·ml-1～125.00 μg·ml-1范围内线性良好，平均回收率为100.9%。结论 该方法简便、可靠、准确，可用于该制剂的质量控制。

【关键词】 反相高效液相色谱法　单体绿原酸　含量测定

　　Determinatiom of Chlorogenic Acid Monomer by RP- HPLC

    LIAO Li-yun1,2,XU Xiao-ping2,TIAN Chen-xu2,REN Xia2,TAN Pei2

    （1.Department of Pharmaceutics,Chengdu Medical college,Chengdu 610083,China;2.West China School of Pharmacy,Sichuan University,Chengdu 610041,China）

    Abstract：Objective To determinate the content of CHA for high-purified raw materials by reversed phase high performance liquid chromatography.Methods HPLC condition was C18 column（250×4.6 mm,5μm）with the mixture of acetonitrile- water( containing 0.1％ formic acid)(92∶8)(pH2.6)as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL·min-1 with the detection wavelength at 323 nm.Results The method proved to be linear over the range of 2.50μg·ml-1～125.00μg·ml-1.The average recovery of the assay was 100.9 %.Conclusion The method appeared to be simple,reliable and accurate,and it could be used for the quality control of the preparation.

    Key words:RP-HPLC;chlorogenic acid monomer;determination

     绿原酸(Chlorogenic acid，CHA)，又名3-O-咖啡酰奎宁酸（3-O-caffeoylquinnic acid）是广泛存在于植物中的一种多酚类化合物，其中忍冬类、杜仲、咖啡等植物中含量较高。具有较强的抗变态反应［1］、调节体内血糖［2］、xx氧自由基［3］及xx抗HIV［4］等作用，由于其疗效显著、毒副作用小而引起广泛研究［5,6,7］。

    虽然绿原酸是中药中最常见的化合物，但是由于其化学性质不稳定，纯化困难。在众多的研究文献中主要报道了绿原酸作为中成药主要成分的形式进行分析和含量测定［8-13］。另外关于绿原酸共存物的研究有少量报道［6,7］，但研究对象多为产品粗提物（含量15%～30%），对于工业化生产的单体绿原酸（含量≥99%）的研究，尚少见报道。而现今从杜仲叶中经过提取加工得到的绿原酸其纯度可达98%。为便于生产质量上的控制，本文采用高效液相色谱法测定高纯度绿原酸的含量，方法简便、xx、重现性好，为单体绿原酸质量标准研究控制提供了科学依据。

    1 实验部分

    1.1 仪器和试药

    高效液相色谱仪、LC-6A型高压泵和SPD-10Avp型UV-VIS检测器（日本岛津公司）。UV-2201紫外－可见分光光度计。pHS-25型酸度计（上海雷磁仪器九厂）；绿原酸对照品（中国药品生物制品检定所）；绿原酸原料药(批号：010801，010802，010803)由四川九章生物化工科技发展有限公司提供；乙腈为色谱纯；超纯水；其余试剂均为分析纯。

    1.2 色谱条件的选择

    1.2.1 检测波长选择 由绿原酸流动相中的紫外扫描图谱可知，绿原酸在波长的217.4，232.8和323.6nm处有{zd0}吸收与对照品一致。以保证溶液中存在的物质尽可能分离检出为目的，比较三个波长条件下得出峰的情况，波长323 nm既能检出所有组分，同时受溶剂影响更小。故确定为本试验测定波长为323 nm。

    1.2.2 流动相与色谱柱选择 精密称取于105℃干燥至恒重的本品10 mg，加水 100 ml，使溶解，作为供试品溶液。采用不同型号C18柱，检测波长为323 nm，调节流动相乙腈-水比例、水相pH值，取供试液10μl注入色谱仪，记录色谱图。流动相考察了不同乙睛比例、不同pH值对色谱行为的影响。结果表明，乙腈比例的变化对待测组分保留时间影响明显，乙腈对组分峰的锐度影响明显，pH值的下降可减少色谱峰的拖尾现象，相对提高柱效。{zh1}确定流动相为0.1％甲酸-乙腈（92∶8）（pH 2.6）。

    采用十八烷基键合硅胶柱，对色谱柱Aichroma bandAQ、Zichrom、Hi-tech kromasil、Dikma Diamond、Gemini 150×4.6 mm，5 μm等进行比较筛选。结果表明：十八烷基键合硅胶柱皆能获得较好的绿原酸色谱峰，其中Aichroma bandAQ柱柱效{zg}，柱压较低，理论板数按绿原酸峰计算大于5 000, 绿原酸与杂质xx分离，分离度大于1.5。确定为本试验色谱柱。

    根据流动相及色谱柱的筛选，确定色谱条件为：色谱柱：Aichroma bandAQ C18柱；流动相：0.1％甲酸-乙腈（92∶8）（pH 2.6），检测波长323 nm，流速1.0 ml·min-1，柱温30℃。

    1.3 方法和结果

    1.3.1 溶液的制备 精密称取于105℃干燥至恒重的绿原酸对照品约6.25 mg，置50 ml的量瓶中，加上述流动相溶解定容，摇匀，即得对照品溶液贮备液（绿原酸125.0 μg·mL-1）。

    精密称取于105℃干燥至恒重的样品约20 mg，置于25 ml量瓶中，加上述流动相溶解定容，摇匀。再精密吸取1 ml于10 ml量瓶中，加流动相溶解定容，摇匀，即得样品溶液。

    1.3.2 专属性的考察 分别取阴性样品溶液、绿原酸对照品溶液和样品溶液10 μl，注入色谱仪（图1）。

    图1 阴性样品（A）、绿原酸对照品（B）和样品（C）的色谱图

    Fig.1 HPLC chromatograms of blank sample(A)、CHA reference(B)and sample(C)

    1.3.3 线性关系的考察和{zd1}检测限 取绿原酸对照品贮备液，溶解定容成125.00 μg/ml、75.00 μg/ml、50.00 μg/ml、25.00 μg/ml、12.50 μg/ml、2.50 μg/ml的系列溶液。各取10 μl注入色谱仪，按“1.2.2”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，以样品浓度对峰面积进行回归，结果表明绿原酸在浓度2.50 μg·ml-1～125.00 μg·ml-1范围内线性关系良好。回归方程为：A=44,696C-24,377(r　=0.9993)。

    将绿原酸标准曲线对照品稀释液逐渐稀释进样测定，本品在信噪比S/N≥3时，{zd1}检出量为 0.38 ng。

    1.3.4 精密度试验 精密量取绿原酸对照品溶液10μl，连续进样6次，测得绿原酸峰面积的RSD=0.82%,表明仪器精密度良好。

    1.3.5 溶液稳定性试验 取“1.3.1”项下样品溶液1份，每隔2 h分别进样10 μl，测定色谱峰面积，结果在12 h内峰面积的RSD＝0.97％，表明样品溶液稳定性良好。

    1.3.6 重复性试验 按“1.3.1”项下方法，对同一批样品，平行制备样品溶液6份，分别测定绿原酸的含量，求得含量得RSD＝0.43%，表明分析方法重复性较好。

    1.3.7 加样回收率试验 取于105℃干燥至恒重的样品适量，精密称定19.60 mg，按“1.3.1”项下方法配制得样品溶液。分别取样品溶液1ml于9个10 ml量瓶中，分成三组，再分别加入浓度为125.0 μg·ml-1对照品溶液各0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml，各取10 μl，按“1.2.2”项下色谱条件进行测定，记录各浓度对应色谱峰面积，计算回收率，结果见表1。表1 回收率测定结果

    1.3.8 样品的含量测定 按“1.2.2”项下色谱条件，各取对照品和样品溶液10 μl进样，按照外标法，以峰面积计。测定3批样品 (批号010801、010802、010803)的含量，结果标示百分含量为99.90%、100.7%、99.28%，RSD分别为 0.61%、1.00%、0.28%（n＝3）。

    2 讨论

    2.1 由色谱条件筛选以及重复性、重现性等考察结果表明，本品在不同ODS色谱柱，不同流动相，不同色谱仪和不同操作人员等因素，皆能获得分离较好的绿原酸色谱峰，以难分离的杂质（如咖啡酸）对绿原酸分离作为评判指标，采用0.1％的甲酸pH在2～3之间，绿原酸柱效达到5 000以上，绿原酸共存杂质的干扰可较好的排除，满足含量测定的要求。

    2.2 含量测定时，分别采用了经典容量滴定法、紫外分光光度法和高效液相色谱法对本品的含量测定。UV法:本品是由咖啡酸和奎尼酸缩合的缩酚酸，结构中有共轭基团，能产生紫外特征吸收，可用紫外分光光度法测定其含量。酸碱滴定法: 本品是由咖啡酸和奎尼酸缩合的缩酚酸，具有游离羧基，可采用碱滴定液直接滴定，结果见表2。

    比较结果表明，三种方法对绿原酸含量测定结果基本一致，但是由于绿原酸来源于植物，在生产、储运等过程中，可能会产生共存杂质和降解产物，同时本品存在的有关物质如咖啡酸与本品具有类似结构和紫外吸收等，酸碱滴定法和UV法的选择性相对较差，造成测定结果的偏离。而HPLC法则通过分离后对绿原酸组分进行定量，可以较好的选择测定绿原酸成分，并能有效地避免共存杂质的干扰。所以本试验{zh1}采用高效液相谱法作为本品的最终含量测定方法。所采用的含量测定方法准确、快速、灵敏。

【参考文献】
　　［1］Hemmerle H,Burger H J,Below P,et al.Chlorogenic Acid and Synthetic Chlorogenic Acid Derivatives:Novel Inhibitors of Hepatic Glucose-6-phosphate Translocase［J］.J Med Chem,1997,40(2):137-145.

［2］Schindle P W,Below P,Hemmerle H,et al.Identification of New Inhibitors of Hepatic Glucose-6-phosphate Ranslocase［J］.Diabetologia,1994,37［suppl.1］:A134.

［3］Ohnishi M，Morishita H,Iwahashi H,et al.Inhibitory Effects of Chlorogenic Acids on Linoleic Acid Peroxidation and Haemolysis ［J］.Phytochemistry,1994,36(3):579-583.

［4］Sengupta A,Ghosh S,Das S.Tomato and Garlic Can Modulate Azoxymethane-induced Colon Carcino -genesis in Rats［J］.European Journal of Cancer Prevention,June 2003,12(3):195-200.