色谱分离技术的演变和发展

（张卫）

一、实验目的

1．学习薄层吸附色谱展开剂和柱色谱中洗脱剂的选择原则。

2．学习用色谱法分离和鉴定化合物的操作技术。

二、实验原理

层析分离是利用混合物的各组份随着流动的液体或气体（称流动相）通过另一种固定不动的固体或液体（称固定相）时，在两相中分配（选择性溶解）、吸附或其他亲和性能的差别，达到分离的目的（原理参见 2.2.9）。  

偶氮苯在通常情况下采取反式结构，紫外光照下发生异构化，形成一部分顺式结构。由于顺式偶氮苯的极性比反式偶氮苯稍大，可利用薄层色谱（TLC）将二者分离。甲基橙的分子极性大于次甲基蓝，实验中采用柱层析法进行分离。

三、实验仪器与试剂

仪器：载玻片，锥形瓶，50ml烧杯，毛细管，层析缸，色谱柱，脱脂棉花

    试剂：光照过和未光照过的偶氮苯-苯溶液，硅胶G，0.5％羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液，20:1的环己烷-乙酸乙酯展开剂，甲基橙和次甲基蓝混合溶液，中性Al₂O₃，95％乙醇，去离子水

四、实验步骤

1．顺式和反式偶氮苯的分离

（1）薄层板的制备

取7.5×2.5cm²左右的载玻片5片，洗净晾干。

在50ml烧杯中，放置3g硅胶G，逐渐加入0.5％羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液8ml，调成均匀的糊状，用滴管吸取此糊状物，涂于上述洁净的载玻片上，用手将带浆的玻片在玻璃板或水平的桌面上做上下轻微的颠动，并不时转动方向，制成薄厚均匀、表面光洁平整的薄层板，涂好硅胶G的薄层板置于水平的玻璃板上，在室温放置0.5h后，放入烘箱中，缓慢升温至110℃，恒温0.5h，取出，稍冷后置于干燥器中备用。

（2）点样

取2块用上述方法制好的薄层板，分别在距一端1cm处用铅笔轻轻划一横线作为起始线。取管口平整的毛细管插入样品溶液中，在板的起点线上点1％的未光照的偶氮苯的苯溶液和光照过的偶氮苯的苯溶液两个样点，样点间相距1～1.5cm。如果样点的颜色较浅，可重复点样，重复点样前必须待前次样点干燥后进行。样点直径不应超过2mm。

    （3）展开

    用20:1的环己烷-乙酸乙酯混合溶液为展开剂，待样点干燥后，小心放入已加入展开剂的250ml层析缸中进行展开，点样一端应浸入展开剂0.5cm。盖好盖子，观察展开剂前沿上升至离板的上端1cm时取出，尽快用铅笔在展开剂上升的前沿处划一记号，晾干后观察分离的情况，比较二者R_ƒ值的大小。

2. 柱层析分离甲基橙与次甲基蓝染料

(1) 将内径约1.5cm的色谱柱洗净后在底部放入一小团脱脂棉花。

(2) 称量7g中性Al₂O₃放入小烧杯中，并用10ml 95％乙醇调匀，另外加入5ml 95％乙醇于色谱柱中。

(3) 打开色谱柱活塞，控制乙醇流速为1滴/s，将Al₂O₃从柱顶一次加入柱内，并用装有橡皮塞的玻棒轻轻敲击管外壁，使其填装均匀。

    (4) 待Al₂O₃全部下沉，通过转动轻敲使Al₂O₃柱顶成均匀平面，然后在表面轻经地覆盖一张圆形滤纸。

(5) 当乙醇液面降至滤纸表面时，关闭活塞，用滴管沿管壁加入1ml次甲基蓝与甲基橙（1:1）的乙醇混合液。

(6) 打开活塞，仍控制流速为1滴/s，当混合液降至滤纸面时再关闭活塞，用滴管沿管壁滴入1～2ml 95％乙醇，洗去粘附在柱壁上的液滴，打开活塞，让洗涤液降至滤纸面时，再加入3ml 95％乙醇。

(7) 在色谱柱顶上装上滴液漏斗，用95％乙醇淋洗，洗脱速度1滴/s，观察色层带的形成和分离。

(8) 当蓝色次甲基蓝色带到达柱底时，更换接受器，收集全部此色带，然后改用水为洗脱剂，同时更换接受器。

(9) 当黄色甲基橙色带到达柱底时，再更换接受器，收集全部色层带。

(10) 色谱分离结束后，拉开活塞将柱内氧化铝倒入废物桶内，切勿倒入水槽。

(11) 回收次甲基蓝乙醇溶液和甲基橙水溶液。