二、基本原理 核酸分子的基本骨架是相邻核苷酸间的3’→5’磷酸二酯键，一个矛盾便是核苷酸为一个多官能基团的分子，且人工化学合成核酸分子必定是一个多步连续的反应，因此要求副反应尽可能的少，否则目的产物的产率以及纯化的难度会使合成失败。所以化学合成的基本过程便是在合成过程中尽可能的将不需要的基团暂时保护起来，在一轮缩合反应之后，再将上一轮基团上的保护基选择性的脱下来，以形成专一的磷酸二酯键。 三、固相亚磷酰胺三酯法 对此方法的最简单描述是：溶液中的单体通过缩合反应形成3’→5’磷酸二酯键，从而连接到固相支持物上。下面是较详尽的描述： 基本材料： 支持物：固相合成是将核酸固定在固相载体上完成合成反应的，最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠（CPG，controlled pore glass），CPG的孔径根据所合成的寡核苷酸的长度而定，一般合成链长小于60nt时，选择孔径500埃，链长大于60nt时，使用1000埃CPG，使用CPG的缩合效率高达98%-99.9%，可以满足合成长达175nt的寡核苷酸的条件。CPG通过连接化合物与初始核苷酸的羟基共价结合，核苷酸的5’羟基用二甲氧基三苯甲基（DMT）保护。 单体：合成所用单体为核苷亚磷酰胺，是经过化学修饰的核苷酸，含下面几个功能基团。 1. 3’位P上二异丙胺基，缩合所用的功能基。 2. 3’位P上腈乙基，保护基，合成完毕后脱去。 3. 5’-DMT，保护基，缩合前脱去。 4. A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基，合成完毕后脱去。 5. G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基，合成完毕后脱去。
反应步骤： {dy}步----去封闭（Deblocking）,用三氯乙酸（TCA）去除CPG所连核苷上的DMT,以暴露5’羟基，供下一步缩合。此步需要注意TCA为一较强的酸，可能会有脱嘌呤作用,故TCA与寡核苷酸接触时间不要超过规定时间。 第二步----活化（Activation）,在缩合之前，单体与四唑混合并进入合成柱，此时四唑提供一个质子给3’磷酸上二异丙胺基的N原子，质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团，与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保证了单体活化充分。 第三步----连接（Coupling），亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时，与其5’羟基发生亲核反应，发生缩合并脱掉四唑，合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。 第四步----盖帽（Capping）,为了防止未反应的与CPG相连的5’羟基在随后的循环中被延长，需要在连接反应充分进行之后使之封闭，常用乙酰化来封闭此羟基。临用前混合乙酸酐和N-甲基咪唑等形成一活性很强的乙酰化试剂，与少量未参与连接反应的5’羟基缩合成酯键。由于须封闭的羟基少且乙酰化试剂活性高和充分过量，此步反应速度很快，几秒钟即足够。太长的盖帽时间有在非预期位置发生乙酰化反应的可能，且增加乙酸酐与痕量水形成酸攻击新生成的亚磷酯键的危险性。 第五步----氧化（Oxidation），连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键（磷为三价）与CPG上相连的寡核苷酸链连接，此亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应注意{zh1}一个循环时，氧化步骤不可省略。此外亦可用其他氧化剂来完成氧化，从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。 循环上述一至五步，寡核苷酸链即可延伸至所需长度时即可完成。
四、合成后处理： 1. 切割：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG上连接化合物与初始核苷间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。 2. 脱保护基：须在此步前选好后续的纯化方法。一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、苯甲酰基、异丙基，用三氟乙酸脱5’-DMT. 3. 纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18柱、OPC柱、PAGE和HPLC。 4. 定量。根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。 5. 储存。通常一次合成提供的寡核苷酸的量会比所需要的量大得多，所以会涉及到寡核甘酸的储存问题。一般来说，这不成为问题，因为寡核甘酸的稳定性很好。需要注意的是避免紫外线等剧烈的物理环境，避免反复冻融，-20℃可稳定保存一年以上。 五、DNA合成产物回收纯化方式 合成仪上合成的粗产物，我们使用浓氨水将寡核苷酸链从载体CPG上化学切割下来并脱去碱基环上的保护基团，再使用各种纯化方式去除合成过程中形成的短片段，得到合乎要求的DNA片段。 六、测序基本原理 Sanger末端终止法: DNA寡核苷酸片段的纯化策略 有几种技术可用于纯化DNA寡核苷酸片段。选择正确的方法与以下因素有关寡核苷酸片段的应用目的、技术成本、是否具备某些设备、时间及预期产量。 有四种普遍接受的DNA寡核苷酸片段纯化方法，即脱盐、OPC、HPLC和PAGE，下文将对每一技术做一简要介绍。 用固相亚磷酰胺三酯法自动合成后，寡核苷酸必需从CPG固相支持物上分离下来，并用浓氨水处理除去碱基上的保护基团。寡核苷酸从CPG上分离出来后，粗产物溶液包含各种杂质及反应副产物，其中有短片段、氨、盐及自由保护基团(如苯酰胺)。 短片段或失败序列在所有自动合成的DNA产品中均存在，这是由于碱基间的连接效率低于{bfb}的缘故。每次连接后都积累短片段，但每一种短片段浓度均很低。粗略地估计(假如每次连接效率为99%)，每次连接后短片段以1%的速度递增，因此，一个典型的（20 mer）寡核苷酸粗产物大约有20%的短片段，这些短片段可通过层析法或电泳法去除。 由于去除CPG支持物和脱保护是在浓氨水中进行的，所以粗产物中含有各种盐分。脱氧腺嘌呤、脱氧胞嘧啶在脱保护时有苯酰胺出现。虽然据报道胺、盐不会影响PCR及测序，但会干扰激酶反应。这些杂质可用脱盐法去除，也可用OPC、HPLC、PAGE电泳的方法除去。 脱盐纯化 脱盐纯化的DNA寡核苷酸片段的纯度可以满足大部分分子生物学研究。最为可信的一种方法是利用反相C-18 层析柱进行脱盐。寡核苷酸片段合成后末端带有DMT封闭基团。粗制寡核苷酸片段随缓冲液进入层析柱后就被吸附在柱内。一些杂质，如氨、盐，不能被吸附，首先被洗脱，然后用有机溶剂洗脱寡核苷酸。这种技术成本较低，效果较好，但不能去除短片段。 另一种脱盐方法是凝胶过滤。DNA粗产物通过一种装有葡聚糖或其它凝胶过滤基质的柱子，杂质及不到10个碱基的短片段扩散入基质的小孔隙中，而寡核苷酸片段分子量较大，不能扩散入小孔隙中，所以首先流出。这种方法便宜、可靠。 尽管上述脱盐技术可去除杂质及小于10个碱基的短片段，长于10个碱基的短片段则需更为有效的方法去除，如OPC、HPLC或PAGE。
Cartridge(OPC)纯化 Cartridge纯化是用一种较便宜的反相层析柱对寡核苷酸进行纯化。这种方法可以去除杂质如氨、盐和短片段，所以寡核苷酸的纯度很高，但纯化回收量受Cartridge柱的容量限制。 Cartridge纯化通常被称为“穷人”的HPLC。这是由于运用了反相层析柱，而没有用昂贵的HPLC设备。这种技术用了一种小塑料胶囊(Cartridge)，内装聚苯丙乙烯多聚树脂作为纯化载体，Cartridge柱内的填料与反相HPLC柱的十分相似。 合成DNA寡核苷酸片段(Oligo)的最终产物上带有DMT。纯化就是基于DMT与树脂的亲合力。Oligo上只有{zh1}一个碱基带有DMT，其它碱基的DMT基团在逐步的合成过程中已被去除。因此，原则上只有真正所要合成的DNA片段末端有DMT，而短片段杂质末端无DMT。末端DMT就象一个“把手”，让树脂在纯化过程中“抓紧”目的DNA片段。 用注射器将粗Oligo溶液注入树脂中，目的片段被吸附在树脂上，而杂质被洗出。然后用一种弱酸洗脱DMT基团，再用有机溶剂将纯化好的寡核苷酸片段洗脱。 Catridge柱的纯化容量受柱子内填充的树脂量限制，容量不大，这是由于Cartridge最初是针对PCR应用而设计的，PCR一般只用几个OD的纯化寡核苷酸已经足够了。 HPLC纯化 纯化中应用的HPLC方法有离子交换和反相HPLC两种。 离子交换HPLC一般用于分离较短的片段。该法是基于各个分子所带电荷不同而进行分离的。目的序列与短序列相比带有较多数目的电荷。但对仅差一个碱基的两条较长片段，离子交换HPLC难以将它们分开，尤其是连接效率较低时更是如此。 反相HPLC纯化可以提供很纯的产品及很高的产量，与Cartridge纯化相似，这种技术也是依赖于目的DNA片段末端所带DMT与柱子内填充的树脂间的亲合力。更新的聚氯乙烯共聚树脂有更大的样品容量及更可靠的回收量，另外，它们可耐高PH值，因此，使用起来很方便，也大大延长了柱子的寿命。因此，应用聚合柱子的反相HPLC法已成为xxx的寡核苷酸纯化的方法。可以制成各种规格的柱子，以纯化各种合成规格的产品，如0.05、0.2、1.0及10mmol的产物均可纯化，回收率一般超过75%，HPLC图谱可记录产品纯度。 PAGE纯化 PAGE法是纯化的另一种方法，也能提供纯度很高的寡核苷酸。这种技术是基于带电荷的寡核苷酸片段在凝胶电泳时的迁移率差异，而分离不同长度的寡核苷酸。目的DNA片段由于长度{zd0}，在凝胶中运动最慢。该方法比较费时、费力，然而，许多研究人员仍乐于使用PAGE法，主要因为它是大多数生物技术实验室的常规方法。
荧光标记（Fluorescein label） Fluorescein Fluorescein适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，有相对高的荧光吸收，较好的荧光产率以及良好的水溶性。标记蛋白时通常不会产生蛋白沉淀。与其他荧光素类衍生物一样，Fluorescein具有光淬灭率高，pH敏感性强与发射波谱宽的缺点。 主要应用于共焦激光扫描显微法（Confocal laser scanning microscopy）和流式细胞计应用（Flow cytometry）。 FAM 羧基荧光素，Carboxyfluorescein，是荧光素衍生物的一种，5-FAM较6-FAM更经常使用。Carboxyfluorescein-5-succimidyl ester，即5-FAM（NHS）广泛存在于荧光标记试剂盒。 与FITC相比，FAM与氨基反应更快，产物也更稳定，但FITC结合蛋白的量更大且进程更易于控制。 FAM也适用于Argon-ion Laser的488nm光谱线，Abs/Em=492/518nm（pH=9.0），具有荧光素衍生物的普遍特性，在水中稳定。 5-FAM主要应用于DNA自动测序中，标记其中的d/ddCTP（PE公司），也经常用于PCR产物定量，核酸探针等。 TET 四氯荧光素，Tetrachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。 TET，HEX，FAM和TAMRA可配合用于DNA自动测序中，其中TET用于标记d/ddATP，HEX用于标记d/ddGTP或d/ddATP（PE公司） HEX 六氯荧光素，Hexachloro fluorescein，是荧光素衍生物的一种。
|
