刘涛题记：我们公司{zx1}发明专利：关于荧光定量PCR的引物研究，并且已经申请国家专利“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”，这个技术不仅对于荧光定量PCR具有突破型改进，而且对于xx普通PCR的二聚体背景问题都也极为有效。觉得这对于PCR相关实验具有一定的参考价值。需要了解相关信息，可以和我联系，我可以免费提供学术讲座：刘涛 13901091570 89755276

                                        荧光染料实时定量PCR的引物研究

                                   江洪^*   张宝林   刘涛

                            （北京泰格瑞分子检验有限公司   北京102209）

摘  要：灵敏度极高的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR试剂盒避免了常规检验检疫方法灵敏度不够的局限，也规避了荧光探针实时定量PCR试剂昂贵和专利垄断，但限于引物二聚体的干扰，难以广泛应用推广。本文采用设计中间部分同序的引物对策略，极大地减少了引物二聚体的形成，检测背景干净，使这一价廉技术不仅可用于临床检验,也广泛适用于食品安全检测。

关键词：引物设计，引物二聚体，荧光染料，实时定量PCR

一、导言：

生命科学尤其是分子生物学发展迅猛，取得了一系列突破性成就，不仅成为自然科学的领头学科，且21世纪也是生命科学研究的世纪，这也成为大家的共识。人们也只有寄希望于生命科学才能xxx类社会所面临的人口膨胀、食物匮乏、能源危机、健康与疾病、和环境与生态恶化等一系列重大问题。随着快速的工业化及全球化，食品逐步从小农经济加工转向大工业化生产为主，为预防“病从口入”以及新食品安全法的实施，进行广泛、常规的食品污染物、致病菌、致病病毒的检验检疫势在必行。

回顾生命科学的发展历程，生命科学是一门实验学科。工欲善其事、必先利其器。可靠的分子检测和定量测定方法既是生物科学研究及其技术推广应用的前提和基础；也是各种临床检验、食品安全检验检疫的重要手段。纵观各种检验、检测方法，重金属等有害元素检测依赖于光谱法测定；三聚氰胺等小分子检测有赖于质谱法或色谱-质谱联用检测；而对于生物活性分子（具有立体构像和相应配体）和生物大分子检测可借鉴临床检验试剂的发展，其大体经历了化学反应检测、酶催化底物检测、放射免疫分析及酶免疫检测、核酸杂交及核酸扩增PCR检测共四个阶段。其中化学反应检测与酶催化底物检测均属于小分子检测；而生物活性大分子的检测主要依赖于抗原-抗体反应的免疫检测，包括放射免疫分析（放免）、酶免疫分析（ELISA）及化学发光免疫分析。这些免疫分析方法是标记信号相加的检测，其灵敏度不高，最小检出量ELISA只能达纳克（ng,约109分子）水平；放免法可达皮克（pg,约106分子）水平，且放免法限于放射同位素应用的限制；化学发光免疫法灵敏度介于二者之间。1988年，美国PE-Cetus公司Kary-Mullis发明了核酸扩增PCR技术，由于其扩增分子是以指数方式增加并检测分析，其灵敏度极高。特别是近年来，美国ABI公司开发出了基于荧光探针Taqman实时荧光定量PCR技术，其灵敏度每个检测可达100拷贝Copies（即102分子）；欧盟Roche公司也开发出了FRET双荧光探针的实时荧光定量PCR技术及专用的Light-Cycler扩增仪。

实时荧光PCR定量分析是通过实时检测扩增产物量（荧光强度）与起始靶基因量直接相关而定量。扩增产物荧光信号达到对数期的循环数Ct值（Cycle threshold）与靶模板起始拷贝数的对数存在负相关线性关系。即起始模板稀释一倍达到对数期荧光强度所需的扩增循环就要增加一个循环数（Ct）。

然而食品安检不仅要求检验技术可靠、灵敏度高，也要求操作简便，特别是还要求检测试剂价格低廉。然而，由于荧光探针费用高并受专利垄断限制，且专用的实时荧光PCR扩增仪昂贵等等。采用荧光探针的实时荧光PCR试剂使用价格远远高于ELISA试剂。因此，Stratagen公司和Qiagen公司等相继开发出了廉价的荧光染料SYBR Green I实时荧光定量PCR技术，荧光染料SYBR Green Ⅰ是一种双链DNA结合染料，游离时不发出荧光，随着双链模板扩增，相对应结合的染料就越多，发出荧光强度达对数期的循环数（Ct值）与最初靶基因浓度存在负对数关系。该技术可兼容任一款式实时荧光PCR仪器，但限于引物二聚体的干扰，引物二聚体双链亦同样有效结合染料而发出荧光。故该技术可靠性不高、尚未xx成熟，限制了其广泛应用。

引物的优劣直接涉及到核酸扩增PCR技术的质量，引物对的特异性（尤其3’端）、长度、GC含量、退火及融解温度、同源互补性及二级结构等等就决定了PCR产物扩增的特异性、产物的有无、本底背景大小、检测灵敏度、是否可定量以及可重复性等等。关于引物的设计工作，现有许多商业引物设计软件如PRIDE、PRIME+、DOPRIMER、PRIMO、MEDUSA和Primer Master等（1）（2），也有更多的在线引物设计网址可供应用选择，如Primer3,Web primer,……等等（3）。然而这些生物信息软件只解决了以上这些一般性优化条件，采用这些原则应用软件设计的没有连续互补序列的引物对，在特异性、长度、GC含量、退火温度Tm值及二级结构上{zy}化的合成引物对在实际工作中总或多或少存在引物二聚体问题，且没有规律性，试验结果重复性差。引物二聚体的形成不仅产生高噪音本底，尤其严重干扰采用荧光染料SYBR Green Ⅰ的实时荧光PCR低拷贝（copy）样本的定量准确性或弱阳性的判断；也竞争性干扰模板的特异性扩增效率，使大多数实时荧光定量PCR技术定量不精准。本文对引物二聚体的形成机理进行了深入研究，极大地减少了二聚体的形成，使荧光染料SYBR Green I实时荧光定量PCR技术可检测到一个拷贝分子的极限，实时荧光定量PCR系统达{zy}化。

二、材料与方法：

1、没有二聚体的引物设计策略：即中间设置部份同序的一引对物的策略。

首先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16～24 base长的优化引物对，在其中间位置，都从5’-3’方向设置一段6～8 basexx相同的序列，引物对3’末端（即相同序列下游尾端）为1～5个base靶特异性序列，{zy}选2～4base绝不连续互补的靶特异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还不能留在最末端；引物对5’端区（即相同序列上游首端区）为4～10个base靶特异性序列，{zh0}选6～8base{jd1}没有连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个互补，最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。接下来是怎样找到引物对中间预选的6～8个basexx相同序列？选择一段靶基因，将其有意义链与反意义链都从5’-3’端方向排序（Alignment）分析，有4～5base相同序列的较多，6～8base以上xx连续相同的情况少见一些，大部分基因总会有一段这样中间隔100-300bp的回文序列。再按上面的原则选优。

2、标本DNA提取：取样本200-400μl.，加等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提一次，再氯仿抽提一次，上清加3倍的DNA结合缓冲液(6M碘化纳NaI)移至商业DNA纯化柱(质粒小提纯化柱,详细步骤按Qiagen/Tiagen公司说明书进行)，洗涤缓冲液(含70%EtOH 的2M NaI液)洗柱两次，加40μl dH2O洗脱收集纯化的样本。大量体积酚-氯仿抽提液须加1/10体积的3M乙酸钠(pH5.2)和2.5倍无水乙醇或等体积的异丙醇沉淀。

3、SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量单个反应：

模板(Template )                           10μl

上游正向引物F(5μM)                    0.5μl

下游反向引物R(5μM)                    0.5μl

10mM dNTP                              0.5μl

10×Taq buffer                            2.5μl

Taq                                     0.5μl

SYBR Green I                           1.5μl

dH2O                                     9μl

                                                       25μl

实际操作时,每个样本取40μl,加入30μl A液(包括:上游正向引物F 2μl, 10mM dNTP 2μl, SYBR Green I 6μl, dH2O 20μl)和30μl B液(含: 下游反向引物R 2μl, 10×Taq buffer 10μl, Taq 2μl, dH2O 16μl)。然后每个样本分取3份X 25μl平行检测,分析统计结果。

上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型和MJ Inc. DNA Engine OptionTM2)。首先变性94℃4分钟，然后40-45个循环，95℃ 20-30秒，52-54℃ 20-30秒，72-74℃20-30秒。于72-74℃读取荧光值,并设置52℃-95℃融解曲线分析。

2、乙型肝炎病毒载量实时荧光PCR检测：
    下面以应用最广的乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）实时荧光定量PCR分析为例，进行中间部份同序一对引物的SYBR Green I实时定量PCR实验。
乙型病毒性肝炎（简称乙肝）由乙型肝炎病毒 HBV引起的一种世界性的传染性疾病。在我国人群中乙肝感染率非常高，极大的危害了人们的身体健康。目前乙肝的检测方法主要有酶免疫法、放免法、化学发光法、免疫荧光法、核酸扩增（PCR）荧光定量法等。酶免疫法应用较广，但是实时荧光PCR定量法可以xx测定乙型肝炎病人的病毒载量,对感染者病毒复制水平的判断,病情传染性及抗病毒xx疗效监测具有无法替代的重要作用。
    选取乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）X区（1545-1887）序列如下:
加粗部分为保守区，划线部分为实时荧光PCR扩增引物。将全长该序列克隆到pUC19载体作为乙肝阳性对照序列。
AB493827  X区（1545-1887）
CTCCCCGTCT GTGCCTTCTC ATCTGCC GGACCGTGTG CACTTCGCTT CACCTCTGCA CGTAGCATGG AGACCACCGT GAACGCCCAC CAGGTCTTGC CCAAGGTCTT ACACAAGAGG ACTCTTGGAC TCTCAGCAAT GTCAACGACC GACCTTGAGG CATACTTCAA AGACTGTTTG TTTAAAGACT GGGAGGAGTT GGGGGAGGAG ATTAGGTTAA AGGTCTTTGT ACTAGGAGGCTGTAGGCATAAATTGG
TCTGTTCACCAGCACCATGCAACTTTTTCCCCTCTGCCTAATCATCTCATGTTCATGTCCTACTGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGG  (343bp)

HBV实时荧光PCR定量引物采用以上公式原则设计, 引物对序列如下:
HBVQF:   5’-ctt cgc ttc acc tct g-3’
QHBVR:  5’-t gcc tac agc ctc cta-3’
（下划线序列为中间同序部份）

(1) 临床血标本DNA提取: 取血清或血浆200-400μl.，加等体积的饱和酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提一次，再氯仿抽提一次，上清加3倍的DNA结合缓冲液(6M碘化纳NaI)移至商业DNA纯化柱(质粒小提纯化柱,详细步骤按Qiagen/Tiangen说明书进行)，洗涤缓冲液(含70%EtOH 的2M NaI液)洗柱两次，加40μl dH2O洗脱收集纯化的样本。

 (2) SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR定量反应：
标本DNA (Template )                     10μl
HBVQF (5μM)                            0.5μl
QHBVR (5μM)                            0.5μl
10mM dNTP                              0.5μl
10×Taq buffer                            2.5μl
Taq                                     0.5μl
SYBR Green I                           1.5μl
dH2O                                     9μl
                                                       25μl
实际操作时,每个样本取40μl,加入30μl A液(包括:上游正向引物F 2μl, 10mM dNTP 2μl, SYBR Green I 6μl, dH2O 20μl)和30μl B液(含: 下游反向引物R 2μl, 10×Taq buffer 10μl, Taq 2μl, dH2O 16μl)。然后每个样本分取3份X 25μl平行检测,分析统计结果。
上实时荧光PCR仪(西安天隆公司TL988型和MJ Inc. DNA Engine OptionTM2)。首先变性94℃4分钟，然后40-45个循环，95℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃30秒。于72℃读取荧光值,并设置52℃-95℃融解曲线分析。
(3)实验结果(见图三, 图四)分析:
图三与图四分别为不同次HBV实时荧光定量PCR的Ct值实验结果，和Ct值与乙肝模板拷贝数线性分析。样本HBV初始浓度与测量Ct值线性关系非常好,各稀释点重复性{jj0}。

四、讨论：

    根据单一引物自身不形成二聚体，引物相似度与二聚体形成高度相关性，尤其单一引物与其自身倒置序列也产生二聚体的实验结果。对引物二聚体形成机制进行分析探讨。

一般的高度互补引物对二聚体形成机理是以其3’末端大段连续的互补碱基对头（一条5’-3’方向，另一条3’-5’方向）方式配对结合，末端在聚合酶和底物dNTP作用下延伸，形成二聚体双链。而优化的引物对没有连续互补碱基形成的合力，其3’末端极少几个不连续互补碱基形成氢键的能力太弱，不足以抵抗引物链因大量磷酸基团负电荷所形成水化分子颗粒之间的斥力及分子热运动的阻力，即使降低引物溶液温度也不足以配对结合，还需要除3’末端外的更多个不连续互补碱基的合力才能促使3’末端极少的互补碱基氢键形成。因此，推论一般优化引物对形成二聚体过程是：优化引物对首先是均以5’-3’方向平行配对，以多个不连续互补碱基的合力形成多处氢键，促使引物对3’末端靠近并使末端扭曲，以局部对头配对，将末端极少的不连续互补碱基配对形成氢键，再互为“引物”延伸形成引物二聚体。单一引物自身不能形成二聚体的机理也就清楚了：首先自身引物对以5’-3’方向平行xx不能配对，仅靠3’末端极少的不连续互补碱基不足以形成氢键，{jd1}形成不了二聚体。当然,单一引物其一3’末端也可以对头方式与另一引物5’区偶尔配对，其极少的互补碱基借助3’末端以外的多处不连续互补碱基合力而形成氢键，产生极少量的短二聚体,其解链温度低于65℃，基本不影响本底。

而同一反向引物对, 序列xx相同，仅其中一条颠倒顺序的引物对，对头时虽xx相同，不形成二聚体；但均以5’-3’平行配对时总会形成一些多个不连续间隔的氢键，助其3’末端配对结合，延伸形成二聚体，与普通引物对无异，见图二DHBVF。

引物对设计的核心关键: 首先如绝大多数已发表的引物设计策略，引物对正反两个方向相比较都不能有连续的互补碱基。但是,引物对平行之间(均5’-3’方向平行对比,逐一或许平移比对)有多个相近的不连续间隔的互补碱基亦是影响引物二聚体形成的关键因素。关于这方面的实验、理论和引物设计还尚未见报导。引物设计时选择没有(排除)任何连续的互补碱基的引物较容易, 但对于多数长约20个base的引物，由于仅4种碱基的排列组合很容易产生多处不连续的、间断的互补碱基，足以影响二聚体的形成。怎样将这些不连续的互补碱基数降低到数量最少和合力最小。策略是在引物对序列中间设置一段序列xx相同的部分以提高引物对的相同性,并将相同序列置于不连续的互补碱基序列中间以分散它们的合力，分散越远合力就越小。

由此得出一创新引物设计原则: 首先遵守一般引物设计所有原则，选择一对16～24 base长的优化引物对，在其中间位置，都从5’-3’方向设置一段4～10basexx相同的序列，优选设置6～8basexx相同序列；引物对3’末端（即相同序列下游尾端）为1～5个base靶特异性序列，优选2～4base绝不连续互补的靶特异性序列，也尽量避免不连续的单个互补碱基，最多允许一对互补，还不能留在最末端；引物对5’端区（即相同序列上游首端区）为4～10个base靶特异性序列，优选6～8base{jd1}没有连续互补的靶特异性序列，尽量选择较少的不连续的单个互补，最多只允许间隔的3对不连续互补碱基。

接下来是怎样找到引物对中间预选的6～8个basexx相同序列？首先选择一段靶基因，将其有意义链与反意义链都从5’-3’端方向排序（Alignment）分析，有4～5base相同序列的较多，6～8base以上xx连续相同的情况少见一些，大部分基因总会有一段这样中间隔100-300bp的回文序列。再按上面的原则选优。如果机遇不佳，只能找到4～5base的相同序列，也可选择引物对的其中一条在相同序列的上游相邻处（即引物中间）突变一个碱基与另一条相同,增加一个相同碱基，达到5-6个basexx相同序列,并在这一条引物5’端和3’端,各再加1～2个base原靶序列的相应碱基以弥补中间碱基突变所造成的退火温度损失。

{zh1}结论：采用一对中间部份同序的引物的实时荧光定量PCR背景干净，灵敏度可达一个分子的极限，加上价廉、操作简便、兼容国产荧光PCR仪。我们SYBR Green I实时荧光定量PCR试剂是食品安检的最上佳选择。

*为通信作者。

五、参考文献：

(1) F. John Burpo, A critical review of PCR primer design algorithms and cross-hybridization case study.,  Biochemistry 218：1-11，Aug 2001。

(2) Vinay K. Singh & Anil Kumar, PCR Primer Design., Molecular Biology Today 2(2):27-32,2001。

(3) Kamel A. Abd-Elsalam, Bioinformatic tools and guideline for PCR primer design.,

African Journal of Biotechnology Vol.2(5).pp91-95,May,2003。