氨基酸纸上层析

一、实验目的

   1、通过氨基酸的分离，学习并掌握纸层析

   的原理和操作技术；

   2、掌握分配层析法；

   3、掌握影响分配系数的因素。

   层析分离技术是利用被分离的混合物中各组分物理化学的性质（分子的形状和大小、分子极性、吸附力、分子亲和力、分配系数等）的不同，使各组分以不同程度分布在两相（流动相和固定相）中，当流动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动，从而达到分离。

层析分离技术在20世纪初就已得到应用；

1903年用于植物色素的分离；

1931年用氧化铝柱分离了胡萝卜素的两种同分异构体；

1944年出现了以滤纸作为支持物的纸层析。

层析分离的种类很多：

   1、按流动相的状态分类：

   （1）液相层析（2）气相层析；

2、按固定相的使用形式分类：

   （1）柱层析（2）纸层析（3）薄层层析等；

   3、按分离过程所主要依据的物理化学性质分类：

   （1）吸附层析（2）分配层析（3）离子交换层析

   （4）凝胶层析（5）亲和层析等。

  二、实验原理

   纸层析：

   是以滤纸作为支持物的分配层析法，是20世纪40年代发展起来的一种生化分离技术。由于设备简单，操作方便，所需样品量少，分辨力较高等优点而广泛的用于物质的分离，并可进行定性和定量的分析。缺点是展开时间较长。

   分配层析法：

   是利用物质在两种或两种以上不同的混合溶剂中的分配系数不同，而达到分离的目的的一种实验方法。在一定条件下，一种物质在某种溶剂系统中的分配系数是一个常数即α=溶质在固定相的浓度/溶质在流动相的浓度。

溶剂系统：由有机溶剂和水组成，水和滤纸纤维素有较强的亲和力，因而其扩散作用降低形成固定相，有机溶剂和滤纸亲和力弱，所以在滤纸毛细管中自由流动，形成流动相，由于混合液中各种氨基酸的分配系数值不同，其在两相中的分配数量及移动速率（即迁移率Rf值）就不同，从而达到分离的目的。

移动速率：Rf=原点到层析点中心的距离/原点到溶剂前沿的距离。

   影响Rf值的主要因素：

   Rf决定于被分离物质在两相间的分配系数以及两相间的体积比。由于在同一实验条件下，两相体积比是一常数，所以主要决定于分配系数。不同物质分配系数不同，Rf也就不同。

   （1）物质的结构和分子极性：

   结构不同极性不同，在两相中的溶解度也就不同，物质的极性决定了物质在水和有机溶剂之间的分配情况，极性大的易溶于水中即固定相中，Rf小；反之Rf则较大；

   （2）层析溶剂：

   首先，溶剂的纯度要高，否则需经预先处理（酸碱抽提，重蒸馏，脱水干燥等）；其次，溶剂系统选择应考虑被分离的物质在溶剂系统中的Rf在0.05～0.85，样品被分离物质的组分的Rf之差{zh0}大于0.05。再次，有些溶剂系统需必须新鲜配制，如正丁醇-甲酸-水系统久放易引起酯化；{zh1}，溶质和溶剂之间若能形成氢键，对分配系数的影响很大；

   （3）pH值：

   溶剂、滤纸和样品的pH值都会影响物质的解离，从而影响物质的极性和溶解度，使Rf改变；溶剂的pH还可以影响流动相的含水量，溶剂的酸碱度大，吸水量多，使极性物质的Rf增加（将滤纸和溶剂用缓冲溶液处理）；

（4）滤纸：

   层析滤纸由高纯度棉花制成，要求滤纸要清洁，质地均一，厚薄一致，纤维松紧度适中，具有一定的机械强度，要被溶剂所饱和。

   不同型号的滤纸，其厚薄程度、纤维松紧度各不相同，因此，滤纸纤维结合水的量不一样，两相的体积比也就不同，Rf也不同；

   另外，滤纸的杂质也会影响Rf，必要时进行预处理（可用0.01～0.4M的HCl处理除去金属离子）；

   （5）室验室的温度和时间:

   温度影响物质在两相中的溶解度，即影响分配系数；也影响滤纸纤维的水合作用，影响固定相的体积；也显著地影响溶剂系统的含水量，即影响流动相的组分比例，层析必须在恒温条件下进行，某些对温度敏感的溶剂系统，{zh0}不配制成饱和溶液。层析时间长Rf大。

   （6）展开方式：

   下行法（层析缸上部有一盛展开剂的液槽,滤纸点样端向上进入槽中，重现性差，斑点易扩散）Rf大，上行法Rf小；环行法（{zh0}用无方向性的特制滤纸）用圆形滤纸层析时，由于内圈较外圈小，限制了溶剂的流动，Rf较小。

   （7）样品溶液中杂质：

   如氯化钠的存在会影响氨基酸的Rf值。

  三、实验材料、仪器和试剂：

   1、实验材料：谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品

   2、仪器：(1)毛细管(2)电热吹风机(3)层析缸(4)层析滤纸 （5）小型玻璃喷雾器（6）铅笔、直尺等。

   3、试剂：

   （1）氨基酸标准溶液：亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸、组氨

   酸标准品。

   （2）溶剂系统：

   正丁醇：甲酸：水=15：3：2（体积比）摇匀；

   （3）0.25%的水合茚三酮溶液。

  四、实验步骤：

   1、样品的准备：称取谷氨酸、组氨酸、脯氨酸、亮氨酸标准品各1mg混合溶于10%异丙醇中。

   2、滤纸的准备：取一长方形滤纸，在滤纸纵向对应的两边距边沿2cm处，各画两条平行线，一条作前沿标志，一条作点样线，在点线上每隔2cm画一个“+”作为点样位置，共5个点。

   3、点样：用毛细管点样，中间的点混合氨基酸，两侧点四种标准氨基酸；每个点样点重复点5次，每点一次用电吹风吹干后再点下次（此时，用冷风吹干，防止氨基酸变性降解），点样点的直径应控制在2mm左右，点样完毕用大头针将滤纸做成筒形，点样面向外,注意纸的两边不要接触。

   4、展层：

   向层析缸中加入层析溶剂，液层不要超过点样线，（高约1.5cm，约50－60ml溶剂）将滤纸点样点朝下放入层析溶剂中，将层析缸密闭，待溶剂到达标志线后取出，冷风吹干。

   5、显色：

   用喷雾器将0.25％茚三酮显色剂均匀喷在滤纸上，热风（加快反应）反应吹干显色。

   五、实验结果与计算：

   1、用铅笔将层析色谱轮廓和中心点描出来；

   2、测量原点至色谱中心和至溶剂前沿的距离，计算各种氨基酸色谱的Rf值。

   3、分析混合样品中未知氨基酸的组分。