【关键词】  定量PCR

　　关键词: 定量PCR;探针杂交;定量试剂

　　摘 要:目的  研制一种能用于仪器操作的灵敏、快速、特异的定量试剂. 方法  使用一个生物素标记的上游引物，对HBV DNA及其竞争模板DNA进行不对称PCR扩增，使扩增出的单链带有生物素，并可结合在固定有链亲合素的微孔板的表面.用标有辣根过氧化物酶的待测模板探针和竞争模板探针分别与两个微孔中固定的相应单链PCR产物杂交，而后加底物显色，测定吸光度进行分级定量分析. 结果  该定量方法可以检测10拷贝数的模板，而且对简便处理的标本适应性强;以分级定量的形式定量时，具有良好的重复性. 结论  该试剂适用于仪器操作，可对临床血清中HBV DNA进行分级定量分析. 

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　　A quantitative PCR kit used in automatic genetic amplification instrument
    
　　GUO Yan-Hai　YAN Xiao-Jun　MENG Xian-Run　CUI Da-Xiang　HOU Yu　HAN Feng-Chan　FENG Yong-Qiang　ZHANG Ju　ZHAO Jin-Rong
    
    1 Institute of Gene Diagnosis of Chinese PLA，Fourth Military Medical University，Xi'an710033，China，
    
　　2 Xi'an Instrument Factory，Xi'an710082，China
     
　　Keywords:quantitative PCR;probe hybridization;quantita-tive kit
    
　　Abstract:AIM A sensitive，rapid and specific quantitative reagent used in quantitative PCR instrument was researched and the content of HBV DNA in serum was quantified.

　　METHODS The HBV DNA and the competitive DNA tem-plate were asymmetrically amplified by a bio-labeled up-stream primer，the single string PCR products with Biotin were combined to the surface of the streptavidin fixed wells.Then the HRP-labeled sample probe and the competitive probe were hybridized with the single-string PCR products fixed in two wells respectively，and then the substrate was added to and Ab values were examined.The result of quanti-tative assay was given by computer.RESULTS 10copy template can be quantified by this kit.The simple preparation of samples DNA is also adapted to this kit and the results can be repeated.CONCLUSION This kit can be used in instru-ment and quantify the content of HBV DNA in serum.
    
　　0 引言
    
　　用PCR技术进行核酸定量分析，有较大的难度.首先，PCR在扩增过程中，初期扩增产物量与循环数呈指数关系，在扩增后期进入平台期，定量分析应在指数关系区进行.但由于PCR扩增效率受多种因素的影响，使得这种定量条件很难控制.二是临床样品中待测核酸含量值跨度很大（可能在1～106 拷贝/μL），对于跨度如此之大的检测对象，要进行准确定量本身就很困难.竞争PCR定量方法虽不受扩增平台期现象的影响，但该方法定量的量程窄，要测定临床标本的核酸含量，就需用多个不同浓度的竞争模板分别对同一样品进行多次检测.为了克服竞争PCR定量方法的缺点，便于仪器自动检测，我们采用竞争PCR产物杂交―酶标显色法进行分级定量.这种定量方法克服了以往竞争PCR定量的不足，初步实现了半定量核酸分析.
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料  主要仪器与试剂:全自动（定量PCR）基因扩增仪（本所）;pUC19HBV DNA质粒为本所克隆.引物与探针:PCR引物源于HBV DNA X基因区［1］ ，引物:B1（1402～1421）5'-Bio ATCCT-GCGCGGGACGTCCTT3';B2（1626～1607）5'-CGTTCACGGTGGTCTCCATG3'，探针位置与序列为（1600～1580）5'HRP-TGCACTTCGCAT-CACGTCTGG3'，其5'端标记有辣根过氧化物酶（HRP），由美国Maxim Biotech.Inc制备.血清标本:72例HBV DNA阳性血清，由本校西京医院检验科提供.20例HBV DNA阴性血清，由本校西京医院中心血库提供.
    
　　1.2 方法  经典DNA提取方法按文献［2］进行.简便DNA提取法:30μL血清加入30μL处理液（10mmol?L-1 Tris-HCl pH8.0，1mmol?L-1 EDTA，1mL?L-1 NP40）煮沸15min，7000g离心5min，吸取上清5μL作PCR模板［3］ .亲和素包被微孔板按文献［4］进行.不对称竞争PCR扩增［3］ :PCR反应体积为30μL，其中引物B1，B2分别为50pmol，1pmol.扩增条件为:首先94℃预变性2min，然后94℃30s，60℃40s，72℃40s共循环25次，取PCR产物10μL进行杂交酶标显色.杂交酶标显色检测［5］ :准确吸取两份PCR反应产物各10μL，按1∶9分别稀释（稀释液:4.3mmol?L-1 Na2 HPO4 ，1.4mmol?L-1 K2 HPO4 ;0.5mL?L-1 Tween20;40mmol?L-1 NaCl，2.7mmol?L-1 KCl，pH7.2）于待测微孔和竞争微孔中，混匀后，再分别从中各吸取10μL溶液，再同样按1∶9分别稀释于新的待测微孔和竞争微孔中，混匀后，再同前稀释1次，这样待测产物和竞争产物各有3个微孔，稀释度分别为10-1 ，10-2 ，10-3 ，37℃放置10min，然后弃去微孔内溶液，用包被液洗2次，再加入100μL探针溶液（1μmol?L-1 探针），于震荡器上37℃震摇20min，用包被液洗微孔3次，加入显色底物100μL（0.1g?L-1 TMB，0.3mL?L-1 H2 O2 ），37℃放置10min，加入0.5mol?L-1 H2 SO4 终止液50μL终止显色反应，用全自动（定量PCR）基因扩增仪测定450nm下的吸光度（A）算出定量结果.
    
　　2 结果
    
　　2.1 定量PCR方法的灵敏度  将pUC19HBV DNA质粒定量稀释成每管105 拷贝、104 拷贝、103 拷贝、102 拷贝和10拷贝用该定量方法进行定量检测，循环程序为25次，准确吸取扩增产物10μL进行PCR产物杂交酶标显色，杂交酶标显色法可检测到初始模板量为10拷贝（Fig1）.
    
　　2.2 杂交酶标显色法的特异性  对10份HBV DNA阳性和10份HBV DNA阴性标本进行PCR扩增25个循环以后取产物进行杂交酶标显色，10份HBV DNA阳性标本最终A分别为1.121，3.000， 2.080，2.258，0.646，1.252，1.143，0.389，0.912，0.537，而10份HBV DNA阴性标本A分别为0.210，0.217，0.195，0.196，0.184，0.175，0.177，0.188，0.176，0.198，cut off=0.325.阴阳标本被明显区分，说明该方法的特异性强.
    
　　图1 略
    
　　2.3 重复性试验  将pUC19HBV DNA质粒定量稀释，用该定量方法进行测定，每种浓度的模拟样品各测10次，当Logcopy为0.5，1.5，2.5，3.5，4.5和5.5时，其Geomatic分别为0.48±0.175，1.46±0.171，2.51±0.133，3.52±0.136，4.48±0.155和5.55±0.172.都在相应的等级内，结果无差异. 2.4 临床标本HBV DNA的分级定量测定  用传统的酚/氯仿抽提乙醇沉淀法和简便法分别对临床72例HBV DNA阳性标本和20份HBV DNA阴性标本进行处理，PCR扩增25次循环，结果72份阳性标本中杂交显色检测对两种处理方法的检出率分别为:{bfb}（72/72），91.7%（66/72），20份HBV DNA阴性血清结果都为阴性（Fig2）.
    
　　图2 略
    
　　3 讨论
    
　　由于酶标显色的线性范围窄（0.3～3.0A之间）;同时要用一种浓度竞争模板测定101 ～105 拷贝的待测模板，为此我们采用了物理稀释的办法，将PCR产物在杂交微孔中连续3次10倍稀释，即10倍，100倍和1000倍稀释，用全自动（定量PCR）基因诊断仪测定落在线性检测范围内的{zd0}稀释倍数的微孔的吸光度，然后根据竞争模板和待测模板产物的吸光度比值，算出定量结果.基本算式为:待测模板初始量=竞争模板初始量?待测产物吸光度（A）/竞争产物吸光度（A0 ）.我们采用分级定量的方法来表示测定结果.将定量结果分为6级分别为:<1×10
1 拷贝为Ⅰ级;≥1×101 ～<1×102 拷贝为Ⅱ级;≥1×102 ～<1×103 拷贝为Ⅲ级;≥1×103 ～<1×104 拷贝为Ⅳ级;≥1×104 ～<1×105 拷贝为Ⅴ级;≥1×105 拷贝为Ⅵ级.
     
　　用该方法对6种浓度的模拟样品分别进行10次测定，可以看出距竞争模板浓度（1×103 拷贝）相差越远，标准差越大，Ⅰ级和Ⅵ级的标准差分别为1×100.175 和1×100.172 ;Ⅲ级和Ⅳ级的标准差分别为1×100.133 和1×100.136 .虽然如此，它们的误差仍在1个数量级以内，不会影响分级定量的结果.对72例HBV DNA阳性血清和20例HBV DNA阴性血清分别采用酚/氯仿抽提乙醇沉淀法和简便法进行HBV DNA提取，对它们进行分级定量测定，样品的处理方法对分级定量结果影响不大.说明该定量方法能适应临床标本的简便处理方法. 

　　参考文献:
    
　　［1］Ono Y，Onda H，Sasada R，Igarashi K，Sugino Y，Nishioka K.The complete nucleotide sequences of the cloned hepatitis B virus;subtype adr and adw ［J］.Nucleic Acids Res，1983;11（6）:1747-1757.

    ［2］Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T.Molecular cloning:A lab-oratory manual ［M］.2nd ed.USA:Cold Spring Harbor Labo-ratory Press，1989:456-472.

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    ［4］Bortolin S，Chritopoulos TK.Detection of BCR-ABL transcripts from the Philadelphia translocation by hybridization in microtiter wells and time-resolved immunofluorometry ［J］.Clin Chem，1995;41（5）:693-699.

    ［5］Jacobs MV，Snijders PJ，van den Brule AJ，Helmerhorst TJ，Meijer CJ，Walboomers JM.A general primer GP5+/GP6（+）-mediated PCR-enzyme immunoassay method for rapid de-tection of14high-risk and6low-risk human papillomavirus genotypes in cervical scrapings ［J］.J Clin Microbiol，1997;35（3）:791-795.