荧 光 抗 体 组 合 的 选 择 在进行流式细胞仪多色分析时，如果想得到理想的分析结果，就需要选择好抗体的荧光搭配。通常情况下，看起来可能会有几种可能“正确”的选择，但是，在确定组合选择之前，还必须考虑到一些影响因素。 1. 抗体结合荧光素的荧光强度 每一种荧光素的相对荧光强度都不一样。一个特定抗体，能否区分阴性与阳性结果，取决于该抗体用何种荧光素标记。下图显示了用五种不同的荧光素标记相同的单克隆抗体，得到了不同的染色结果。 2. F/P比值 抗体上标记荧光素的数量（F/P比值）也会影响相对荧光强度。每一个抗体上标记几个FITC或PerCP分子（通常为2-9个），而APC和PE的标记量约为每个抗体标记一个荧光分子。FITC为小分子化合物，而PE、PerCP和APC则是分子量较大的荧光蛋白。受荧光标记物的化学性质要求限制，IgM型抗体通常只用小分子的荧光素进行标记，如FITC、Texas Red、Cy3和Cy5。 3. 抗原密度 高表达的抗原几乎可以用任何荧光素标记的抗体检测，而较低表达的抗原则需要用较高S/N比值的荧光素（如PE和APC）标记的抗体检测，从而达到有效区分阳性细胞群和阴性细胞的目的。 4. 自发荧光 每个细胞群体的自发荧光水平都不同，尽管可以观察到高荧光强度的细胞，但自发荧光在高波长范围里（>600nm）迅速降低。 l 检测自发荧光水平高的细胞时，使用发射光波长较长的荧光染料（如APC），可以得到较好的S/N比值。 l 如果自发荧光水平不太高的细胞，那么，使用较长波长的激发光激发，对于提高阴性阳性差别的现象影响不明显。可以使用FITC标记的抗体。 5. 非特异性结合 有些荧光标记的抗体会表现出低水平的非特异结合，就会造成阴性细胞的荧光水平升高。这种非特异结合通常由以下几种因素造成： l 单克隆抗体的同型对照： 一些IgG型同型对照更易与某些类型的细胞的Fc受体结合。 l 使用的荧光素： 有时Carbocyanin（Cy3、Cy5和Cy5.5）和Texas Red直接标记的抗体，以及某些tandom偶联抗体，与某些细胞亚群的结合性增强。对Cy5来说，研究表明，这主要是由于染料与低亲和性Fc受体的弱相互作用造成的；PE-Cy5标记的抗体也有类似作用。 另外，在某些情况下（如用Anti-HLA-DR PE/Anti-Monocyte PerCP-Cy5.5分析单核细胞），也可以利用这种特性，有意在标记抗体时增加Carbocyanin染料的标记量，这样，就可以保证无论各个单核细胞的CD14表达水平的高低差别有多少，都可以检测到单核细胞。 |
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