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色素

实验 8 叶绿体色素的定量测定
一、原理
根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长下测定其消光度，即可用公式计算出提取液中各色素的含量。
根据朗伯–比尔定律，某有色溶液的消光度 D 与其中溶质浓度 C 和液层厚度 L 成正比，即：
D = kCL （ 17 – 1 ）

式中： k 为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为 1cm 时， k 为该物质的比吸收系数。各种有色物质溶液在不同波长下的比吸收系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的消光度而求得。
如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总消光度等于各组分在相应波长下消光度的总和，这就是消光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在 3 个特定波长下的消光度 D ，并根据叶绿素 a 、 b 及类胡萝卜素在该波长下的比吸收系数即可求出其浓度。在测定叶绿素 a 、 b 时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的{zd0}吸收峰。
已知叶绿素 a 、 b 的 80 ％丙酮提取液在红光区的{zd0}吸收峰分别为 663nm 和 645nm ，又知在波长 663nm 下，叶绿素 a 、 b 在该溶液中的比吸收系数分别为 82.04 和 9.27 ，在波长 645nm 下分别为 16.75 和 45.60 ，可根据加和性原则列出以下关系式：

D 663 = 82.04C a +9.27C b （ 17- – 2 ）
D 645 = 16.75C a +45.60C b （ 17 – 3 ）

式中： D 663 、 D 645 ——叶绿素溶液在波长 663nm 和 645nm 时的消光度；
C a 、 C b ——叶绿素 a 和 b 的浓度， mg/L 。
解方程组 17 – 2 、 17 – 3 得：

C a = 12.72D 663 – 2.59D 645 （ 17 – 4 ）
C b = 22.88D 645 – 4.67D 663 （ 17 – 5 ）

将 C a 与 C b 相加即得叶绿素总量 C T ：

C T = C a +C b =20.29D 645 + 8.05D 663 （ 17 – 6 ）

另外，由于叶绿素 a 、 b 在 652mn 的吸收峰相交，两者有相同的比吸收系数（均为 34.5 ），也可以在此波长下测定一次消光度（ D 652 ）而求出叶绿素 a 、 b 总量：
C T = （ D 652 × 1000 ）／ 34.5 （ 17 – 7 ）
在有叶绿素存在的条件下，用分光光度法也可以同时测定出溶液中类胡萝卜素的含量。 Lichtenthaler 等对 Arnon 法进行了修正，提出了 80 ％丙酮提取液中 3 种色素含量的计算公式：
C a = 12.21D 663 – 2.81D 646 （ 17 – 8 ）
C b = 20.13D 646 – 5.03D 663 （ 17 – 9 ）
C x = （ 1000D 470 – 3.27C a – 104C b ）／ 229 （ 17 – 10 ）

式中： C a 、 C b ——叶绿素 a 和 b 的浓度。
C x ——类胡萝卜素的总浓度。
D 663 、 D 646 和 D 470 ——叶绿体色素提取液在波长 663 nm 、 646 nm 和 470 nm 下的消光度。
由于叶绿体色素在不同溶剂中的吸收光谱有差异，因此，在使用其他溶剂提取色素时，计算公式也有所不同。叶绿素 a 、 b 在 95 ％乙醇中{zd0}吸收峰的波长分别为 665nm 和 649nm ，类胡萝卜素为 470nm ，可据此列出以下关系式：

C a = 13.95D 665 – 6.88D 649 （ 17 – 11 ）
C b = 24.96D 649 – 7.32D 665 （ 17 – 12 ）
C x = （ 1000D 470 – 2.05C a – 114C b ） /245 （ 17 – 13 ）
二、实验材料、试剂与仪器设备
（一）实验材料
新鲜植物叶片（或其他绿色组织）。
（二）试剂
• 95 ％乙醇（或 80 ％丙酮）。
• 石英砂。
• 碳酸钙粉。
（三）仪器设备
分光光度计，研钵 1 套，剪刀 1 把，玻棒， 25 mL 棕色容量瓶 3 个，小漏斗 3 个，直径 7 cm 定量滤纸，吸水纸，擦镜纸，滴管，电子天平（ 0.01 g 感量）。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。
2. 称取剪碎的新鲜样品 0.3 g ，共 3 份，分别放入研钵中，加入少量石英砂和碳酸钙粉及 2 ～ 3 mL95% 乙醇（或 80% 丙酮）研成匀浆，再加乙醇 10 mL ，继续研磨至组织变白，静止 3 ～ 5 min 。
3. 取滤纸 1 张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到 25mL 棕色容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，{zh1}连同残渣一起倒入漏斗中。
4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。{zh1}用乙醇定容至 25 mL ，摇匀。
5. 把叶绿体色素提取液倒入比色杯内。以 95 ％乙醇为空白，在波长 665 、 649 和 470 nm 下测定消光度。
6. 按公式 17 – 11 、 17 – 12 、 17 – 13 （如用 80 ％丙酮，则按公式 17 – 8 、 17 – 9 、 17 – 10 ）分别计算叶绿素 a 、 b 和类胡萝卜素的浓度（ mg/L ）， 17 – 11 、 17 – 12 式相加即得叶绿素总浓度。
四、结果计算
求得色素的浓度后再按下式计算组织中各色素的含量（用每克鲜重或干重所含叶绿体色素的毫克数表示）：
（ mg/g ）
[ 注意事项 ]
1. 为了避免叶绿素的光分解，操作时应在弱光下进行，研磨时间应尽量短些。
2. 叶绿体色素提取液不能浑浊。可在 710 或 750 nm 波长下测量消光度，其值应小于当波长为叶绿素 a 吸收峰时消光度值的 5 ％，否则应重新过滤。
3. 用分光光度计法测定叶绿素含量，对分光光度计的波长xx度要求较高。如果波长与原吸收峰波长相差 l nm ，则叶绿素 a 的测定误差为 2 ％，叶绿素 b 为 19 ％，使用前必须对分光光度计的波长进行校正。校正方法除按仪器说明书外，还应以纯的叶绿素 a 和 b 来校正。
4. 在使用低档型号分光光度计（如： 72 、 125 、 721 型等）测定叶绿素 a 、 b 含量时，因仪器的狭缝较宽，分光性能差，单色光的纯度低（± 5 ～ 7 nm ），与高中档仪器如岛津 UV-120 、 UV-240 等测定结果相比，叶绿素 a 的测定值偏低，叶绿素 b 值偏高， a ／ b 比值严重偏小。因此，使用时必须用xx分光光度计对低档的分光光度计进行校正。
[ 思考题 ]
1 ．叶绿素 a 、 b 在蓝光区也有吸收峰，能否用这一吸收峰波长进行叶绿素 a 、 b 的定量分析 ? 为什么 ?
2 ．为什么提取叶绿素时干材料一定要用 80 ％的丙酮，而新鲜的材料可以用无水丙酮提取？

【附注】叶绿体色素简便提取方法
采用上述研磨方法提取叶绿体色素，既费工费时，又容易出现误差。为此，可采用乙醇–丙酮混合液浸泡法。其方法是，将待测叶片剪碎，装入具塞刻度试管中，加入乙醇–丙酮混合液（ 1 ∶ l ， v ／ v ） 10 mL ，使叶片xx浸入液体之中，加盖。放置于暗处，如能置于 30 ～ 40 ℃温箱中更好。当叶片xx变白时即可比色。此法简便易行，重现性好，尤其适用于大量样品的测定。{zh0}是在浸泡过程中轻轻摇动几次。

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