维生素K维生素K维生素K过度
以下介绍蔬菜（蔬菜，粮食）的测定，维生素K1方法（ HPLC法） ，以及食品和饲料中的水溶性维生素（维生素的食物） K3 （维生素K3 ）测定方法
之一，蔬菜中的维生素K1的测定方法高效液相色谱法
1 。原则维生素K1蔬菜中有机溶剂提取后，失活的磷酸盐处理氧化铝柱净化，然后液相色谱分离的维生素K1和定性和定量测定。
2 。适用标准适用于所有类型的蔬菜，绿色的植物和干品中维生素K1的测定。
3 。仪器： （ 1 ）常用的实验室设备（ 2 ）破碎机（ 3 ） 202 – R型电气炉（ 4 ）栏： 0.8厘米× 30厘米的玻璃柱，逐渐底部的收缩和配备了活塞，活塞约1厘米有一个玻璃盘，孔径16 ? 30μm板，柱底的体积膨胀大约三十〇毫升液体池。将干燥后使用（ 5 ）旋转蒸发仪旋转旋转蒸发器蒸发匹配瓶：塞浦路斯，圆底，量一百五十○毫升。 （ 6 ）火锅在恒温水浴（ 7 ）高纯氮（ 8 ）高速离心机高速离心机离心管小封装：一个插件，体积为1.5 ?三点○毫升。 （ 9 ）紫外线（ 10 ）高效液相色谱法：高效液相色谱法，紫外探测器
4 。试剂，但对蒸馏水试验，为分析纯试剂，有机溶剂重新蒸馏后使用。
3.1无水硫酸钠：用前在150 ℃烤箱内4 ? 8小时烘烤xx水分。
3.20.14mol/LNa2SO4解决方案：检查二〇克无水硫酸钠，用蒸馏水溶解量为1升。
3.3丙酮：分析纯。
3.4石油（石油产品）醚：沸程30 ? 60 ℃ ，分析纯。
3.50.6mol / L的碘化钾溶液：采取一〇克碘化钾说，用蒸馏水溶解量100毫升。
三点六五克/ L的淀粉的解决办法：检查0.5克的可溶性淀粉，水溶性量100毫升。
3.7乙醚：分析纯。不包含过氧化氢。 （ 1 ）过氧化氢的方法：使用5毫升醚加1ml0.6mol / L的碘化钾溶液，振摇1分钟，如果过氧化氢是发布了免费的碘，黄河水。或4滴5克/ L的淀粉溶液，水是蓝色的。乙醚来对待使用过氧化氢。 （ 2 ）删除过氧化物方法：瓶重量增加的时期时，蒸汽铁（铁的食物）丝绸， 10%以初馏点和剩余可支配流体流体10% 。
3.8洗脱液：石油醚（ 97 3 ） 。
3.9甲醇：优级纯。
10月3日正己烷：优级纯。
3月11日磷酸氢二钠：分析纯。
中性氧化铝
3月12日： 100 ? 200目。
3月13日氧化铝加工： （ 1 ）铝磷酸盐处理：采取中性氧化铝250克， 20克磷酸氢二钠， 1.6L蒸馏水的锥形量2L一瓶沸水浴30分钟，晃动不时或混合。冷却，排水上层液体（包括暂停小颗粒） ，然后渠道浸出勃兰特。残留转移到平底玻璃盘在150 ℃烤箱中烘烤3 ? 5小时权衡两者之间的差额的3G低于搅拌烘烤过程中不时以避免结块，冷却干燥器购买维护。 （ 2 ）加工氧化铝灭活：使用之前，磷酸盐处理的氧化铝，增加了锥形瓶插件。九点〇毫升每100克氧化铝加去离子水，塞子紧密，蒸气浴或80 ℃加热3 ? 5分钟，猛烈摇晃锥形瓶，使自由流动的氧化铝，不结块。冷却，举行了30分钟，使水的分配。 （ 3 ）核查氧化铝处理：该标准的应用液体一点零毫升，干燥的氮气，石油醚，然后溶解量一点零毫升。柱，然后装了5.3 ，标准的解决方案，增加栏目， 5.4柱层析纯化的步骤，用旋转蒸发收集瓶液体流出洗脱，浓度，氮干燥，用正己烷卷一点零毫升，高效液相色谱法测定，记录的峰面积或峰高（ A ）类。另一种标准的应用液体直接测定记录峰高或峰面积（氩） 。比较A和氩气，其价值为0.97 ? 1.03之间（甲/氩气） ，则说明柱效更好资格处理氧化铝。否则，需要处理再失活。如果重新验证无法实现0.97比率，应重新制备氧化铝。
3.14维生素K1标准：适马公司，纯度“ 98% 。
3.15标准的存储解决方案： 50.0mg精密的维生素K1检查标准，解散正己烷卷五十〇点〇毫升，或1.0mg/ml 。将放在储备液安瓿，冷冻保存。
3月16日标准工作的解决办法：采取标准的存储解决方案的50倍稀释的准确性正己烷，就是20.0μg/ml 。
校准标准的解决方案：采取的标准应用液紫外线价值的决心，波长248nm ，比色杯厚度1厘米，正己烷为空白，以确定3次，以平均浓度按下式计算标准的应用。
X1 =
随即
×米× 103
… … … … … … … … … … … … … … （ 1 ）
é
地点：
X1 -标准应用维生素K1溶液浓度， μg / ml的;阿-标准的应用解决方案价值的平均紫外线;专-摩尔吸光系数， 20,000 ; M -维生素K1分子量450.7 ; 103 -转换为微克/转换因素毫升。
5 。步骤
轻
要求进行的所有行动
5.1样品处理（ 1 ）新鲜蔬菜：净挑选各种各样的事情，该部将食用清洗，擦拭水面，切碎，以打破成匀浆准备机制。 （ 2 ）干燥植物样品：地面， 60目。
5.2取样
的
（ 1 ）已被标记匀浆从标本的2 ? 10克（维生素K1含量不少于2μg ） ，再加上一瓶与圆锥侧，然后加入5至10倍量的丙酮，涵盖与软木，振摇3 ? 5分钟，站立1分钟，下面的步骤按照5.3 。
的
（ 2 ）说，干植物样品0.2 ? 4G技术（维生素K1含量不少于2μg ） ，增加迫击炮，然后增加2至4倍的数额无水硫酸钠样品研磨均匀，增加二十五毫升的丙酮，磨削3 ? 5分钟，站立1分钟。 （注：比较细胞壁厚度的样品，如藻类食物，可用于石英砂研磨，破坏植物组织。需要预处理的石英砂，石英砂，以20目筛筛选，{dy}与浓盐酸浸泡，然后稀氨水浸泡，{zh1}用蒸馏水冲洗至中性干的烤炉。使用每10克增加3 ? 5克样品中的石英砂研磨碗的研究。 ）
5.3洗衣机
将被倒入上层澄清液50 ? 100ml0.14mol/LNa2SO4解决方案，分液漏斗，残留丙酮，然后提取2至3倍的数额不得少于二五毫升，上清液液体小组-渠道。残渣用石油醚洗涤，以3至4次，每次约二十五毫升，向洗衣机是无色液体，液体将涌入同一分洗涤液漏斗中，振摇1分钟，站立。被遗弃的水相，有机相用蒸馏水洗4到5倍，以澄清水相。被遗弃的水相，有机相后，无水硫酸钠脱水旋转蒸发瓶在60 ℃水浴中减压蒸馏时左右2毫升删除，并立即干燥氮气和石油醚数量二点○毫升，将纯化。
5.4干燥设备检查栏柱，以确认一个良好浸泡氧化铝石油醚，湿填写栏，所以，即使是自由流动的氧化铝柱高度20厘米，顶端2厘米无水硫酸钠加。打开活塞调整流速为每秒1滴。列样本只。
5.5色谱净化：流动的石油醚侧0.5厘米柱，增加V1ml提取样品时，样品流量冲洗栏，增加了石油醚2毫升柱洗墙下来。洗脱连同一〇毫升的石油醚， 2倍，除了可支配液流出。然后洗脱三零毫升洗脱液旋转蒸发收集瓶液体流出。流出液在旋转蒸发器浓缩近干，干燥后除去氮，采用正己烷量V2ml 。液量将进入一个小塑料离心管， 5000rpm离心5分钟，上清液的高效液相色谱分析。
5.6标准曲线，从标准的应用维生素K1解决0.5,1.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0毫升，加入分解决方案，渠道，提取了5.2步骤，集中量二点零毫升。一点○毫升摘录了5.4标准的步骤，{zh1}量一点○毫升，这就是标准曲线点的内容，维生素K1 ，分别相当于5,10,20,40,60,80,100 μg / ml的。 5.6 ，然后高效液相色谱法测定的条件，记录峰面积或峰高。标准内容为横坐标，峰面积或峰高的垂直坐标的标准曲线绘制。
高效液相色谱法色谱条件5.7HPLC （推荐条件） ：柱前ultrapackODS ， 10μm的，四点零毫米×四点五厘米。分析柱： ultrasphereODS ， C18柱， 5μm的，四点六毫米× 250毫米。流动相：甲醇，正己烷（ 98 2 ） 。搅拌，临前脱气。进样量： 20μl 。流速1.5ml/min 。紫外检测器：波长248nm 。幅度0.01 ? 0.05 。高效液相色谱法测定稳定：该标准的应用解决方案，高效液相色谱法测定6计算峰面积或峰高的平均值，标准差和RSD% ，如果RSD为“ 1% ，说明稳定的一个良好工具。设备只能稳定样品。
5.8样品分析样品液体净化20μl ，根据色谱条件的定性和定量分析。 （ 1 ） ：一个标准的高效液相色谱保留时间的高峰期。 （ 2 ）定量：样品峰面积或峰高的标准曲线，以确定相应的内容，维生素K1 ，或内容的回归方程获得。
6 。计算
χ2 =
? × 2 × 2版× 100
… … … … … … … … … （ 2 ）
V1导联×米
地点： X2处理器-维生素K1样品内容， μg/100g ; C部分-由标准曲线或回归方程得到确定维生素K1浓度，微克; 2 -样品提取后量量，毫升; V1导联-样品采取时间纯化液体体积，毫升; v2的-纯化样本大小体积，毫升;米-样品质量，湾
7 。注意
的
（ 1 ） 7月1日，让穷人和最小检出量：同一实验室在同一时间或连续测定的结果， 2倍的{jd1}值的相对偏差≤ 10% ，这一{zd1}检测限为0.5 。
的
（ 2 ）这种方法避免使用皂化xx，以减少破坏维生素K1 ;使用灭活磷酸盐处理氧化铝的色谱分离，通过改变极性洗脱液，使分离的维生素K1和杂质，有利于以高效液相色谱法维生素K1的定性和定量分析。
的
（ 3 ）维生素K1是高度脂溶性，不溶于丙酮，石油醚，正己烷，异辛烷溶剂等，不易溶于甲醇，乙醇和其他溶剂。当样品含有更多的水分，如直接使用石油醚或正己烷提取的样品将成为粘性，因此，样本需要提取丙酮，或磨削{dy}无水硫酸钠，然后丙酮提取，可以播放水分的吸收作用，并进一步破坏的组织样本中提取更好。
的
（ 4 ）比前选择的活动报告硅胶或中性氧化铝柱做分离的维生素K1 ，然后一小极性有机溶剂洗脱液。在实际工作中发现，利用硅胶柱，洗脱流速缓慢，金额洗脱液，分离时间;与未经处理的氧化铝柱分离将干扰维生素K1和明确分离的现象。当氧化铝xx磷酸盐，极地氧化铝增加，从而使较小的吸收维生素K1洗脱液洗脱了很容易，但在加入少量的铝水可以提高效率和降低栏维生素K1拖尾峰的现象，为了缩短时间保留，以避免使用氧化铝由于维生素K1可能造成这种现象的分解。
的
（ 5 ）如良好的柱效氧化铝柱，洗脱首次用石油醚应摆脱胡萝卜素和胡萝卜素栏是没有的现象蔓延的黄色带;叶绿素和其他色素留在顶端的列没有没有或只有少量的位移，但并不影响分离效率。
的
（ 6 ）在醚洗脱液多大影响的内容洗脱液极性，如果醚含量少维生素K1可以延长停留时间，相反，可能会干预早期洗脱物质影响净化效率。洗脱液应严格控制的比例醚。
的
（ 7 ） ，根据标准紫外扫描模式，维生素K1 ，维生素K1中可以看出240248纳米， 260269波长有四个特征峰，其中{zd1}峰值260nm 。衡量的标准，以高效液相色谱法测定260nm波长的峰面积为1 ， 240nm ， 248nm和269nm波长下的峰面积分别为1.15,1.23,1.09 。
的
（ 8 ）一般反相色谱法，以甲醇作为流动相极性。在甲醇中加入适量的非极性有机溶剂（如正己烷，异辛烷，等等） ，可以增加溶解能力的维生素K1 ，有利于缩短停留时间，以减少拖尾现象的高峰期。甲醇选择这种方法正己烷（ 98 2 ）为流动相，保留时间的维生素K1为15.6 ± 0.1min 。
的
（ 9 ）的{zd1}检测限为0.5μg/ml这种方法，在1.0 ? 100.0μg/ml峰面积有良好的线性关系。测定结果间的一批相对标准偏差在1.3 ? 7.1% （ 6例） ;回收率为90.9 ? 106.3% 。 。测定不同实验室之间的结果表明，此方法精度，重复性好，分离纯化的影响，和试剂可负担得起的。
第二，食品和饲料中的水溶性维生素K3 （维生素K3 ）测定
1 。原则合成氨的条件下存在的维生素K3 （甲萘醌， VK3 ）与氰化物，形成蓝紫色醋酸材料，在575nm的吸光度值是成正比的浓度维生素K3 ，颜色分光光度计测定吸光度值的材料，定量分析样品的含量维生素K3 。检出限为0.05mg 。
2 。采用这种方法可用于加强粮食和饲料的测定水溶性维生素K3 。
3 。仪器分光光度计
4 。用试剂在本实验的分析试剂级水为蒸馏水实验。 （ 1 ） 0.1mol / L的碘的解决办法：检查25gKI解散20毫升水，增加九点八克碘，搅拌溶解，加水到七百五毫升。储存于棕色瓶，和暗保存24小时。 （ 2 ） 0.1mol / L的硫代硫酸钠：煮沸的水冷却后。检查25gNa2S2O3 5H2O的溶解于500毫升的0.1gNa2CO3的冷却水，冷却水和稀释1000毫升。 （ 3 ）淀粉指标：采取的2G的可溶性淀粉，除了一十毫升水，动摇。然后缓慢增加到二〇 〇毫升沸水煮2分钟。 （ 4 ）氨水，异丙醇（ 1 1 ）解决方案：量异丙醇和混合氨浓度。 （ 5 ）乙氰（ 30克/升） ：采取的3G氰乙酸乙酯溶解于100毫升的异丙醇。 （ 6 ） VK3标准溶液（ 0.1mg/ml ） ：准确50mgVK3检查标准，以500毫升棕色容量瓶，使用异丙醇解散规模和数量。
5 。测定步骤进行所有业务需要光提取5.1 ：准确的说，搅拌约一十五克的样品已被准确地加入100毫升的水，搅拌10分钟，以确保充分溶解和混合VK3 。过滤器，如滤液浊度，然后反复过滤澄清。 5.2氧化：吸取四十零毫升以100毫升容量瓶滤液，加1 ? 2滴淀粉指标， 0.1mol / L的碘滴定解决持续蓝色。涓滴1下拉解决0.1mol/LNa2S2O3xx蓝色。水量规模。 （注：碘的作用，解决为氧化剂氧化还原样品材料，额外淀粉碘溶液可以成为蓝，硫代硫酸钠是xx多余的氧化剂，xx蓝，为了避免影响测定有色金属材料。 ） 5.3标准管和管样品制备： 2套，分别比色管二零毫升，分别按表1的顺序添加VK3标准溶液，提取样品和试剂，样品制备的标准管和管。
表1标准管材样品制备
试剂
标准管
样品管
0
1
2
3
4
空白管
测定控制
VK3标准解决方案，毫升
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
-
-
样本提取，毫升
-
-
-
-
-
10.0
10.0
异丙醇，毫升
3.0
1.50
1.0
0.5
0.0
3.0
2.0
氰乙酸乙酯，毫升
-
1.0
1.0
1.0
1.0
-
1.0
氨-酒精，毫升
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
1.0
水量为二零毫升，摇匀，放置20分钟。
（注意：样品管和标准中的水量管的大小和颜色强度，色彩稳定是密切相关的时间，如果卷的大小是太小了，颜色薄弱，稳定时间短。如果本方法操作，显色反应可稳定在至少2小时。 ）
5.4比色法测定： 575厘米的分光光度计在波长，利用标准的0做空白对照，调节设备测量吸光度值对管。
6 。 VK3计算标准内容为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算出回归方程。样本管与空白对照值的差异吸光度曲线标准样品管VK3确定内容，然后计算的内容，样品VK3 。
X =
钙硼× 25
× 100
米
地点： X -样品VK3含量， mg/100g ;钙硼-样品管和空白的吸光度值的差异，管标准曲线相应VK3含量，毫克; M -样品质量， g25 ─ ─样品稀释;
7 。注意（ 1 ）在同一实验室平行测定或重复测定结果的相对偏差的{jd1}值“ 10% 。 （ 2 ）xx食品不含有维生素K3 ，只有一些可以被用来加强粮食VK3作为增强。报告说，在文献中合成维生素K3可能有一些副作用，虽然目前还没有强有力的证据支持这一论点，但现在应用维生素K3市场产品作为一种罕见的增强。维生素K3饲料常用的一个来源的维生素K ，所以测定维生素K3对饲料的质量控制测试和更有意义。