1.       分离胶的配制：配制12%分离胶（参照配方）。灌胶至玻璃板2/3处，预留浓缩胶的位置。加蒸馏水封闭，凝胶30分钟。水和凝胶界面可见一条折线。

2.       洗涤：弃去上层蒸馏水，洗涤分离胶上层界面。滤纸吸干残留水分。

3.       浓缩胶的配制：配制5%胶浓缩胶（参照配方）。灌胶，插入合适的梳子，凝胶30分钟。

4.       样品制备：取合适的蛋白量与2倍体积上样缓冲液等比混匀，100℃煮沸5分钟。

5.       加样：每个泳道加入10-20ul的上述样品（胶一般在1mm 到1.5 mm）。

6.       电泳：等压电泳（浓缩胶 70V ；分离胶 150V）。至溴酚兰刚跑出即可终止。

7.       平衡：将电泳后的凝胶取出，在转移缓冲液中浸泡平衡15分钟以上。PVDF膜先在甲醇中浸泡10-15秒，再在纯水中浸泡2min，然后同样在转移缓冲液中浸泡平衡15分钟。

8.       按顺序依次放置：（-）海绵垫-滤纸（双层）-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫（+）；并且用玻璃棒仔细去除气泡。PVDF膜的一侧靠近正极，要保持膜是湿润的。

9.       湿转：恒流电泳100 mA。时间大约60~100 min，根据预染Marker的条带进行调整。

10.   洗涤：将PVDF膜取下，用蒸馏水洗涤 2 遍，每次2 min。

11.   封闭：含5%脱脂牛奶的TBST液，过夜。

12.   洗涤：TBST洗涤三遍。每次10分钟。

13. 加入一抗：加入含5%脱脂奶粉TBST稀释过的抗体。

14.   洗涤：TBST洗涤三遍。每次10分钟。

15.   加入 HRP-二抗：用含5%脱脂奶粉TBST稀释到合适的比例

16.   洗涤：TBST洗涤三遍。每次10分钟。

17.   加入ECL底物：1.8~2 ml/膜。 室温2~5分钟。

18.   暗室暴光： 30s~3 min 。（30s 60s 90s 120s）

19.   胶片 依次放到显影液和定影液中浸泡2~5 min。