原位杂交这项技术在医院的病理科一般较为成熟，但也xx于有成套的试剂盒的情况下（因为临床检测项目相对较少也较稳定）。对于一般科研工作者而言，尽管这种实验方法并不难但也让人容易忘而却步，因为要涉及到诸如选择何种探针（cDNA, cRNA还是寡核苷酸探针），样本如何处理保存，探针如何设计，特异性怎样保证等一系列问题。
        本文以一篇文献为背景，详细介绍了以cRNA为探针进行原位杂交检测组织mRNA的表达的详细过程，包括整个实验过程中用的到关键试剂和试剂盒的厂家货号等，通过阅读该篇文章，基本上可以将该方法在自己的实验室建立成功。
文章名称：原位杂交法检测hsp mRNA在猪组织细胞中的分布        

南京农业大学农业部动物生理生化重点开放实验室 李玉保 鲍恩东 赵茹莤

实验设计思路：

        根据hsp70和hsp90 mRNA基因序列，设计共合成引物，将PCR扩增的基因片段克隆至可体外转录的基因载体中（本次使用pGEM-T载体）形成重组质粒，重组质粒经筛选、鉴定、利用限制性内切酶切质粒线性化后，利用体外转录系统，制作地高辛标记的RNA探针，建立检测hsp mRNA原位杂交方法。

实验材料：

     罗氏公司  

     罗氏公司  

     Promega公司   

个人认为需要补充说明的几个方面：
1.  样本处理：
石蜡包埋组织：

        文章中具体做法为：组织样品在4%中性多聚甲醛中固定12小时，修块，继续固定8小时，梯度酒精脱水，二甲苯透明；常规石蜡包埋，切片5um，连续切片，45℃烤片；水化。本人经验：4%中性多聚甲醛{zh0}用DEPC水配制。

冰冻组织：

        罗氏的应用文章中做法为：Tissue preparation Tissue was frozen as soon as possible after excision to prevent degradation of mRNA. The tissue was cut to the appropriate size, and as much of the fatty tissue as possible was removed. The tissue was then immersed in a cryoprotective medium and frozen on cork disks in nitrogen-cooled 2-methylbutan. The tissue was stored at -80°C or in liquid nitrogen. Preparation of cryosections The tissue samples were prewarmed to -22°C and tissue sections were prepared (4μm~12μm, thicker sections may be preferred for confocal microscopy). The sections (2~4) were placed on silanecoated slides and immediately used or stored at -80 °C (up to several months). 
2. 引物设计时应尽量跨内含子设计，这样防止{zh1}制备的探针与基因组DNA杂交，同时应将PCR产物进行BLAST比较，看其特异性如何。探针长度{zh0}不要超过600bp（在罗氏的应用文章有中）
        附：罗氏应用文章这篇文章较好，有蛋白酶K的用法，杂交液等的配制，以及杂交前样本处理等很多实用的内容，建议好好学习一下。

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