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【摘要】   目的 中药活性成分肉桂醛、柠檬醛对黄曲霉细胞膜麦角固醇生物合成的影响，以探讨其xx的作用机制。方法 将黄曲霉接种在含有不同浓度xx的蔡氏固体培养基中，同时设不加xx为空白对照，置26 5℃恒温培养3d，刮取平皿上菌苔，称重、皂化，提取xx中的难皂化脂，高效液相色谱(HPLC)法测定其中的麦角固醇含量。结果 柠檬醛浓度为0 16μg/ml、肉桂醛浓度为0 09μg/ml作用黄曲霉后，麦角固醇含量较未用药组显著降低。结论 肉桂醛、柠檬醛可能通过影响黄曲霉麦角固醇的生物合成抑制黄曲霉生长。

【关键词】   肉桂醛

　　黄曲霉广泛分布于自然界，极易引起物品霉变。食品等物品霉变除造成直接重大的损失外，某些产毒株产生的毒素，还可导致肿瘤高发，严重危害人和动物健康〔1〕。目前主要利用化学防腐剂抑制xx的生长， 化学防腐剂种类繁多，广泛应用于食品方面的有山梨酸、苯甲酸、丙酸及其盐类以及纳它霉素等，但这些防腐剂防霉效果不是很理想，而且对人和动物多有潜在的毒性。中药活性成分肉桂醛、柠檬醛作为食品防腐剂已应用于食品工业，但对其xx机制较少。本室实验表明，中药活性成分肉桂醛、柠檬醛有良好的抗黄曲霉作用〔2-5〕。本文用高效液相色谱(HPLC)法测定了肉桂醛、柠檬醛作用黄曲霉后xx细胞膜麦角固醇含量的变化，以期探讨抗xx的作用机制，旨在为开发新型的食品xx防腐剂提供理论依据。

　　1   材料与方法

　　1 1   实验菌株   黄曲霉菌为标准株(CCCCMID A2)［中国xx中心(南京)］。

　　1 2 仪器与试剂   yknm高效液相色谱仪(美国 Gilching公司)；xx培养箱；紫外分光光度计等。肉桂醛(中国上海双喜香料制剂厂)，比重1 047～1 051(批号：20020401，纯度＞95％)；柠檬醛(德国Berlinrang Vnitden Augen de Haut vermiden公司)批号：002489 S20085632，纯度98%。，比重0 887～0 889(批号：002489 S20085632，纯度＞98％)；酮康唑(纯度：200mg/片，批号：030418108，西安杨森制药有限公司)，临用前将酮康唑研成细粉并溶于二甲基亚砜，使其浓度为40mg/ml；麦角甾醇(美国Sigma公司)，用环己烷配成1 0mg/ml，-20℃保存；乙腈为色谱纯；皂化剂：新鲜配制的含15%NaOH的90%乙醇溶液；蔡氏培养液〔6〕；其他试剂均为分析纯。

　　1 3   方法

　　1 3 1   菌液制备   将试验菌株接种于蔡氏斜面，26℃培养至快速生长早期，活化2次，此时菌苔覆盖斜面，加入蔡氏液体，吸管吹打菌苔使孢子游离于培养液中，用500目无菌尼龙网过滤，滤液经血细胞计数板计数及紫外分光光度计测定，调整孢子浓度为106个/ml。

　　1 3 2   不同浓度药液的制备   参照文献〔2，5〕，于无菌、直径为15cm的平皿内分别加入柠檬醛9 16，6 11μl，肉桂醛6 364，4 364μl，酮康唑4μl，将冷却至50℃左右的蔡氏固体培养基50ml迅速倒入上述平皿内，混匀(xx终浓度分别为：柠檬醛，0 16，0 08μg/ml；肉桂醛，0 13，0 09μg/ml；酮康唑，3 2μg/ml)，待其凝固。

　　1 3 3   高效液相色谱HPLC法测定肉桂醛、柠檬醛对黄曲霉细胞膜麦角甾醇含量的影响   (1)样品制备：将1 3 1制备的菌液接种在含有不同浓度xx的蔡氏固体培养基中(孢子终浓度为104个/ml)，同时设不加xx为空白对照，置26 5℃恒温培养3d，刮取平皿上的菌苔，称菌湿重。各精密称取湿菌约0 5g，加磷酸盐缓冲液(PBS)2 5ml和皂化剂6ml，混匀，80℃水浴皂化60min。加石油醚(沸程30～60℃)6ml提取3次，合并提取液，加水6ml洗涤2次，醚层于60℃水浴挥干，得未皂化脂〔7〕，加环己烷溶解使溶液体积为1ml/g湿菌，-20℃保存。(2)高效液相色谱条件：色谱柱：C8柱；流动相：已腈-水(95∶5)；流速，1 0ml/min；检测波长283nm，采用外标法按峰面积进行定量。(3)标准曲线绘制：精密称取25mg麦角甾醇标准品，用环己烷溶解配成1 0mg/ml作标准贮备液。用标准贮备液分别配制0 5，0 25，0 125，0 0625，0 0325，0 01625mg/ml等6份标准液，在(2)中建立的色谱条件下进样20μl，每个浓度进样2次，以峰面积的均值为纵坐标，样品浓度为横坐标作标准曲线，进行回归处理。(4)精密度测定：在本实验条件下，将0 25，0 125，0 0625mg/ml的标准溶液分别于日内及日间进样，测定日内及日间相对标准差。每个样品重复进样2次。(5)样品测定：将(1)中制备好的样品用本实验建立的色谱条件分别进样20μl，每个样品进样2次，测定样品中麦角甾醇的含量(n=3)。

　　1 4   统计分析   采用SPSS11 0软件进行分析。

　　2   结果

　　2 1   标准品麦角甾醇的出峰时间   按本实验建立的色谱条件进样。结果显示，麦角甾醇的出峰时间在16～17min。

　　2 2   标准曲线   麦角甾醇含量在0 5～0 01625mg/ml范围内的线性回归方程为：y=47 43636x+0 507256(n=6,r=0 999427)，麦角甾醇含量在此范围内与峰面积有很好的线性关系。

　　2 3   麦角固醇的精密度测定   测定日内及日间相对标准差，其RSD(相对标准差)分别在0 12%～1 44%，1 0%～2 02%。说明测定结果的重现性好，见表1。

　　2 4   肉桂醛、柠檬醛对黄曲霉细胞膜麦角甾醇含量的影响   以酮康唑为阳性对照，测定了肉桂醛、柠檬醛作用黄曲霉后麦角甾醇含量的变化。柠檬醛较高浓度0 16μg/ml、肉桂醛0 09μg/ml作用黄曲霉后，麦角固醇含量较相应未用药组减低，差异有意义(P＜0 01)，见表2。

　　表1   麦角固醇的精密度测定（略）

　　表2   用药前后黄曲霉麦角固醇含量比较（略）

　　注：与相应对照组比较，*P＜0 05，**P＜0 01

　　3   讨论

　　肉桂醛、柠檬醛是肉桂、山苍子油的主要成分，且两者已分别用于化工、食品、粮食防腐、医疗卫生。实验表明，两者有良好的广谱抗xx作用特别是有高效的抗曲霉作用。张文娟〔8〕、罗曼〔9〕等研究了柠檬醛致黄曲霉的形态结构和某些宏观影响。麦角甾醇是xx细胞质膜的重要组成成分，它是一种准平面体分子，通过与磷脂结合稳定磷脂相，从而增加膜的稳定性。麦角甾醇的缺乏，必将引起xx细胞膜功能异常，甚至发生细胞破裂。目前用于检测细胞膜中麦角甾醇含量的方法有薄层层析法、高效液相色谱法等〔10〕。反向高效液相色谱分析法具有分析速度快、分离效能高、自动化程度好的特点而被广泛使用。本实验以酮康唑为阳性对照，用反相液相色谱法测定了中药活性成分肉桂醛、柠檬醛作用黄曲霉后细胞膜麦角甾醇含量的变化。实验中发现，一定浓度的xx作用后黄曲霉细胞膜麦角甾醇含量较阴性对照组减少，随着xx浓度的增加，麦角甾醇的含量也随之减少。表明xx影响了细胞膜麦角甾醇的生物合成，从而抑制了黄曲霉的生长繁殖。至于xx抑制了麦角甾醇生物合成的哪一个环节或多个环节，还有待进一步研究。通过测定xx中麦角固醇含量，有助于探讨抗xxxx的作用机制，并为中药活性成分的体外抗xx作用研究提供方法。

【参考文献】
   　　〔1〕 潘崴，庞广昌，张昀.黄曲霉毒素与食品安全［J］.食品研究与开发，2004，25(6)：11-13.

　　〔2〕 谢小梅，许杨，付颖媛.微量液基稀释法测定中药活性成分的体外抗曲霉菌活性［J］.微生物学通报，2003，30(6)：89-93.

　　〔3〕 谢小梅，许杨，方建茹.肉桂醛、柠檬醛对烟曲霉、黄曲霉细胞DNA、RNA的影响［J］.xxx，2005，36(4)：558-560.

　　〔4〕 谢小梅，张文平，付颖媛，等.肉桂醛、柠檬醛抗曲霉菌作用机制的研究［J］.xxx，2004，35(4):430-432.

　　〔5〕 谢小梅，方建茹，许杨.肉桂醛、柠檬醛抗黄曲霉作用的研究［J］.食品科学，2004,25( 9)：32-34.

　　〔6〕 陈世平.xx感染学［M］.沈阳：辽宁科学技术出版社，2000：538-539.
　
　　〔7〕 刘洪涛，高平挥，曹永兵.等.气-质联用研究氟康唑对白xxx甾醇生物合成的抑制作用［J］.中国药理学与毒理学杂志，2002，16(5)：368-371.

　　〔8〕 张文娟.内桂醛抗黄曲霉作用及超微结构观察的研究［J］.北京医科大学学报，1995，27(5)：374.

　　〔9〕 罗曼，蒋立科，吴子健.柠檬醛对黄曲霉质膜损伤机制的初步研究［J］.微生物学报，2001，41(6)：723-730.

　　〔10〕 罗曼，蒋立科，邹国林.柠檬醛致黄曲霉孢子丧失萌发力的机制［J］.中国生物化学与分子生物学报，2002，18(2)：227-233.