类胡萝卜素是一类具广泛应用价值的xx色素，具xx、抗心而管疾病以及作为维生素A的前体，有助于预防和根治维生素A缺乏症，而且它具有人们所喜爱的颜色，井且是人和动物体内重要的生物活性物质，具有增色和营养双重功效。司一作为着色剂和色素添加剂，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。从植物及澡类提取类胡萝卜的生产受自然条件的限制，而化学合成的类胡萝卜素生物活性低，加之毒性问题，小少国家己限制使用。多种微生物具有合成类胡萝卜素的能力，井且利用微生物生产类胡萝卜素是获得生物资源型类胡萝卜素的最重要途径，xx、霉菌和酵母菌产生类胡萝卜素都有报道。国内以微球菌生产类胡萝卜素还未见报道，因此，挖掘微生物菌种资源对于类胡萝卜素的开发研究很有意义。国外AASE ST1iAlVD等曾对Micrococcus.Roseus菌株MTCC678产类胡萝卜素进行了初步研究，报道了新分离鉴定的微球菌株形成类胡萝卜素及培养条件的研究结果。

1  材料与方法

1.1菌株的分离鉴定

    本菌株由本实验室从无锡惠山野外土壤中分离筛选得到，按照常规的xx分离鉴定方法鉴定为微球菌属（Micrococcus）的一个种玫瑰色微球菌（Micrococcus.Roseus）。

1.2  菌株的培养条件

1.2.1 培养基

     固体斜面培养基2%Glucose,1%Peptone,1%Yeast extract,2%Gel

     液体种子培养基4%Glucose,1%Peptone,1%Yeast extract

     发酵摇瓶培养基2.5%Glu,1%Yeast extract,0.1%K2HPO4,0.1%KH2PO4

1.2.2培养方法

     斜面培养方法

     菌体接入上述的斜面培养基中，28℃下活化培养48h.

     种子培养方法

     将活化好的斜面菌体挑两环于装有30ml液体种子培养基的250ml三角瓶中,28℃、150rpm培养20h。

     发酵培养方法

     取种子培养发酵液3ml(按接种量10%)接于装有27ml摇瓶培养基的250ml三角烧瓶中28℃、150rpm培养96h。

1.2.3 生物量的测定

     干重法：发酵液经离心、洗涤后，于105℃烘至恒重称重,实验进行两次平行测定。

1.2.4 总类胡萝卜素提取和测定

     采用Sedmak et al[6]方法稍加改动，取发酵液在5000rpm离心5min，再用去离子水洗涤菌体2次。在菌体中加入55℃二甲基亚砜，振荡摇匀后10000rpm离心5min，(重复多次至菌体无色)合并上清液，在每10ml上述二甲基亚砜液中加入1ml磷酸钠缓冲液（pH7.0）和15ml正己烷;乙酸乙酯（1：1）振荡萃取后收集上层萃取液为类胡萝卜素提取液,将提取液适当稀释后，测定=490nm时的吸光度OD490后按下列公式计算总类胡萝卜素含量。（实验进行两次平行测定）

1.2.5 总类胡萝卜素的计算［7］

           总类胡萝卜素含量（mg/L）=AxV(ExVf)

             其中A- 吸光度值（OD490）

                 Va- 萃取液体积，mL

                 Vf- 取样发酵液体积，mL

                 E- 消光系数)为0.16

1.2.6 色素的显色反应［8］

     浓H2SO4显色反应:将含有纯色素的石油醚液加入装有浓H2SO4的试管中,观察其颜色变化。浓HCL显色反应:将含有纯色素的石油醚液加入装有浓HCL的试管中，振荡片刻，观察其颜色变化。

1.2.7 吸收光谱测定［9］

     将上述类胡萝卜素提取液以正己烷:乙酸乙酯(1:1)为参比，在UV-3000双光束分光光度计上连续扫描，测定其350~600nm的吸收光谱。

2    结果

2.1 培养条件对菌体的生长及产类胡萝卜素的影响

2.1.1 碳源的影响

     培养基中不同碳源对菌体生长和色素形成情况见表1。可以看出，碳源对菌体生长和色素形成影响很大。综合生物量、色素产量、色素含量三方面因素，在所试验的碳源中，蔗糖对菌体生长和色素形成都最有利，色素量达359.3ug/g干菌体。所以碳源选用蔗糖。

2.1.2 氮源对发酵的影响

     选用常见的无机、有机氮源,等摩尔氮的取代发酵培养基中的酵母膏进行发酵培养。由上表可见，蛋白胨对提高单位发酵液的类胡萝卜素量效果{zh0}，为{zj0}氮源。

2.1.3 磷源对发酵的影响

     磷是核酸与磷酸脂的成分，又对原生质的胶态与细胞质膜的透性起调节作用。再者，磷酸盐对培养基pH值的变化起缓冲作用，因此通常培养基中添加适宜的磷酸盐会对菌种发酵有较大的影响，因此考察了以上几种不同的单一磷酸盐或复合磷酸盐对菌体发酵的影响，表3说明，采用磷酸氢二钠时，无论是类胡萝卜素的产量还是含量都是{zh0}的，因此选择Na2HPO4为{zj0}磷源。

2.1.4 起始pH值对发酵的影响

     不同的起始pH值将直接影响菌体的生长及类胡萝卜素的产量。图1表明,起始pH值对发酵影响很大，培养基初始pH值为6时对该菌种色素生产最有利。

2.1.5 装液量的影响

     微球菌是严格好氧的微生物，可用调节摇瓶装液量来研究通气量对其发酵的影响，结果见图1。当250三角瓶装液量超过40ml时，生物量和类胡萝卜素产量都会显著降低，说明装液量对菌体生长影响很大，由图1可以看出装液量30ml时，类胡萝卜素产量达到{zg}，因此装液量以30ml为宜。

2.1.6 温度对发酵的影响

     微球菌的生长温度范围较广，在10-37℃之间菌体都可以生长，由图3中25-37℃温度范围之内生物量的比较也可以看出在这一区间菌体本身生长量的差异并不大，但类胡萝卜素的产量却有显著的差异，由图中可知，在128℃时类胡萝卜素的产量{zg}为{zj0}培养温度。

2.1.7 正交实验    

结合上述单因素试验，以类胡萝卜素总量为指标，以发酵培养基为基础培养基，其中葡萄糖用蔗糖取代、酵母膏用蛋白胨取代，选取蔗糖、蛋白胨、磷酸二氢钾、起始pH值为考察因素，以L9(34)正交表作正交试验，其因素水平表及正交试验结果分别见表4、表 5。

     根据以上正交实验结果的极差结果可知主次因素为A->B->D->C可能好的的组合为A2B2C2D1，即碳源确定为蔗糖30g/L，氮源确定为蛋白胨7g/L，磷源确定为Na2HPO4 1.0g/L，pH值为5.5，发酵温度为28℃，摇床转速150rpm，装液量30ml，接种量为10%。以此条件下进行发酵,结果为类胡萝卜素产量达 7.66mg/L，菌体生物量为13.46mg/L。分别是优化前用发酵培养基发酵时的3.09及1.55倍。

2.2类胡萝卜素的定性分析

2.2.1色素的显色反应

     将从菌体中提取到的含有纯色素的石油醚溶液倾入装有1-2ml浓H2SO4的试管中，发现在2相交接处呈青兰色。再将从菌体中提取到的含有纯色素的石油醚溶液倾入装有1-2ml浓HCL的试管中，振荡片刻，下层呈浅兰色。以上试验结果说明有类胡萝卜素存在。

2.2.2 吸收光谱的测定

    图2显示菌株在350-600nm范围内的特征吸收峰为467、490、530。因类胡萝卜素类物质在400-600nm之间存在三指吸收峰，因此推知菌株确实含有类胡萝卜素类物质。该菌产生的类胡萝卜素化学结构和理化性质正在深入研究。

3   结果与讨论

    虽然该菌株的生物量及类胡萝卜素产量均较低 ,但色素含量较高,达569.1ug/g干重。并且由于国内用微球菌来生产类胡萝卜素的先例还未见报道，因此，挖掘新的微生物菌种资源生产类胡萝卜素对于类胡萝卜素的开发研究具有深远的意义。

参考文献(略)