动植物组织mRNA提取

一、材料

　　水稻叶片或小鼠肝组织。

　　二、设备

　　研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

　　三、试剂

　　1、无RNA酶xx水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压xx。

　　2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温xx器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。

　　3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris·Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。

　　4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris·Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。

　　四、操作步骤

　　（一）动植物总RNA提取-Trizol法

　　Trizol法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养xx，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA绝无蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase封阻分析和分子克隆。

　　1、将组织在液N中磨成粉末后，再以50-100mg组织加入1ml Trizol液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。

　　2、研磨液室温放置5分钟，然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15秒。

　　3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol液加0.5ml异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10分钟，12000g离心10分钟。

　　4、弃去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5分钟。

　　5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度。然后将RNA溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶 10分钟。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。

　　[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。

　　2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

　　（二）mRNA提取

　　由于mRNA末端含有多poly(A)+，当总RNA流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，mRNA被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

　　1、用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

　　2、将悬浮液装入xx的一次性层析柱中或装入填有经DEPC处理并经高压xx的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3倍柱床体积的xx水冲洗柱床。

　　3、用1x柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH值小于8.0。

　　4、将（一）中提取的RNA液于65℃温育5分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x柱层析缓冲液，上样，立即用xx试管收集洗出液，当所有RNA溶液进入柱床后，加入1倍柱床体积的1x层析柱加样溶液。

　　5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD为0时，加入2-3倍柱床体积的xx洗脱缓冲液，以1/3至1/2柱床体积分管收集洗脱液。

　　6、测定OD260，合并含有RNA的洗脱组分。

　　7、加入1/10体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30分钟。

　　8、4℃下12000g离心15分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗 涤沉淀，4℃下12000g离心5分钟。

　　9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

　　10、用少量水溶解RNA液，即可用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

　　[注意] 1、mRNA在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

　　2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

异硫氰酸胍法

异硫氰酸胍法提取制备模板核酸此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等.

　　1.异硫氰酸胍消化液

　　异硫氰酸胍4mol/L

　　柠檬酸钠(PH7.0)25mmol/L

　　十二烷基肌酸钠0.5%

　　β-巯基乙醇0.1mol/L

　　2.消化方法:用50～100ul细胞悬液及血清，加等体积的异硫氰酸胍消化液振混匀 后，或65℃1小时，或室温放置数分钟，然后加1/10体积的3mmol/L pH5.2的醋酸钠缓冲液，再加等体积的酚:氯仿，用力振摇约10s，10000r/min，离心5min，取上清加等体积异丙醇-20℃放置3h后，14000r/min离心15min，沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1～ 2次，真空干燥，沉淀用TE缓冲液溶解即可用于逆转录PCR扩增，或放-20℃保存.

组织和细胞RNA的制备——（异硫氰酸胍法）

[试剂主要]

1．CSB缓冲液：42mM柠檬酸钠；0.83% N-lauryl sarcosine(十二烷基，N甲基甘氨酸钠)；0.2 mM β-巯基乙醇。

2．变性液：异硫氰酸胍（终浓度 4 M）25g、CSB缓冲液 33ml，混合直至xx溶解，可在65℃助溶。4℃保存备用。

3．2 M乙酸钠：pH 4.0。

4．异丙醇

5．无水乙醇、70%乙醇

6．酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）

7．DEPC H2O：100ml ddH2O中，加入DEPC 0.1ml，弃分振荡，37℃孵育过夜。15磅高压灭茵，4℃保存备用。

[操作步骤 ]

1．样品处理：

（１）培养细胞：收集细胞，离心，500g×5min。对于贴壁培养细胞，用0.25%胰-消化后，用PBS重悬细胞并转移至10ml中；悬浮培养细胞可直接转移；离心：500g×5min；PBS洗涤2次。弃上清，置冰浴。加预冷变性液2 ml，充分摇动，使细胞裂解xx。以下操作均在冰浴中进行。

（２）组织：取1-2g组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置组织匀浆器中，加入预冷的变性液12ml，在冰浴中充分匀浆。

2．加2 M乙酸钠(pH 4.0)0.2ml，混合后将溶液转移至5ml中。

3．加酚：氯仿：异戊醇2.2ml，颠倒混合用力振荡10s，冰上放置10min。

4．4℃离心，12000g×20min。

5．小心吸取上层含有RNA的水相，并转移至一新的5ml中。避免吸取两相之间的蛋白物质。

6．加等体积的异丙醇，置-20℃至少30min，沉淀RNA。

7．4℃离心，12000g×15min。

8．弃上清，再加变性液2ml重悬RNA沉淀物，振荡直至RNAxx溶解（必要时可65℃促溶）。

9. 加入等体积异丙醇，置-20℃ 30min。

10. 4℃离心，12000g×15min。

11. 弃上清，加入70%乙醇4ml洗涤RNA沉淀。4℃离心，8000g×5min。

12. 弃上清，将沉淀晾干。

13. 加入适量DEPC H2O溶液解RNA（65℃促溶10-15min）。

[注意事项]

1．所有实验过程均须避免Rnase的污染。

2．要避免沉淀xx干燥，否则RNA难以溶解。

附二、总RNA定量

RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有{zd0}的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度：

RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000

RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。

来源：易生物：