中华人民共和国进出口商品检验行业标准

　SN 0296一93出口禽肉中莫能菌素残留量检验方法生物自显影法

 Method for the determination of monensin residues in poultry meat for export —Bioautography method

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1 主题内容与适用范围

　　本标准规定了出口禽肉中莫能菌素残留量的抽样、制样和生物自显影测定法。

　　本标准适用于出口冻鸡中莫能菌素残留量的检验。

2　抽样和制样

2.1　检验批

　　以不超过2500件商品为一检验批。

　　同一检验批的商品应具有相同特征,如包装、标记、产地、规格和等级等。

2.2　抽样数量

　　　　　 批量,件　　　　　　　　　　　　{zd1}抽样数,件

　　　　　　　　1～25　　　　　　　　 　　　　　　　　1

　　　　　　　26～100　　　　　　　　　　　　　　　　5

　　　　　　　101～250 10

　　　　　　　251～500 15

　　　　　　　501～1000　　　　　　　　　　　　　　　17

　 　　　　　1001～2500　　　　　　　　　　　　　　　20

2.3　抽样方法

　　按2.2规定的抽样件数随机抽取,逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品,原始样

品总量不少于2kg,放入清洁容器内,加封后标明标记,及时送交实验室。

2.4　样品制备

　　从每袋原始样品中取出部分有代表性样品,将可食部分放入高速组织捣碎机中捣碎均

匀,充分混匀,用四分法缩分出不少于1kg试样。装入清洁容器内,加封后标明标记。

2.5　样品保存

　　将试样于—18℃冷冻保存。

　　注：在抽样及制样过程中,必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。

3　测定方法

3.1　方法提要

　　用甲醇提取肉样中莫能菌素,经xxxx萃取后浓缩至干,以甲醇溶解残留物,用薄

层分离,再用生物自显影法测定。

3.2　设备和材料

3.2.1　微量注射器：50 μL。

3.2.2　薄层板：硅胶,Q/YT 257—85SG,5cm×20cm,使用前110℃活化2h。

3.2.3　展开缸：240mm×57mm×32mm。

3.2.4　游标卡尺：测量范围0～200mm,精度0.02mm或使用抑菌圈测量仪测量。

3.2.5　离心机：转速3000 r/min。

3.2.6　旋转浓缩器。

3.2.7　恒温培养箱：37±1℃。

3.2.8　高压xx器。

3.2.9　长方形培养皿：20cm×10cm×5cm。

3.2.10 均质器：带均质杯250mL。

3.3　试剂和培养基

3.3.1　试剂

3.3.1.1　甲醇：分析纯。

3.3.1.2　xxxx：分析纯。

3.3.1.3 乙酸乙酯: 分析纯。

3.3.1.4　莫能菌素标准品: 960μg(效价)/mg(中国兽药监察所提供)。

3.3.1.5　试验菌种：枯草杆菌(Bacillus subtilis), 菌种号ATCC 6633(卫生部药品生物

制品检定所提供)。

3.3.2　培养基

3.3.2.1　菌种用培养基(见附录A 第A1章)。

3.3.2.2　生物自显影用培养基(见附录A第A2章)。

3.3.2.3　肉汤培养基(见附录A第A3章)。

3.4　测定步骤

3.4.1 工作液制备

3.4.1.1　莫能菌素标准贮备液

　　准确称取适量的莫能菌素标准品,用甲醇溶解配制成浓度为500μg(效价)/mL的莫能

菌素标准溶液。配制后于冰箱中保存,一周内使用。

3.4.1.2　莫能菌素标准工作液

　　吸取标准贮备液,用甲醇分别稀释成2,3,4,5,10和15μg(效价)/mL的标准工作

标准液。以上稀释液均须当日配制。

3.4.1.3　菌种培养及芽胞菌悬浮液制备

　　将菌种安瓿瓶的上部xx后敲碎,加入少量肉汤培养基,使其溶解并移至肉汤管中混

匀。置37±1℃温箱中培养24h。将培养物接种于菌种培养基中,置于37±1℃培养一周,

镜检含芽胞菌数达85%以上, 便可制备芽胞悬浮液。

　　用适量xx生理盐水冲洗菌苔,然后将该菌液转移至离心管中,充分摇匀后,于3000

r /min离心30min, 弃去上清液,再加入同样量的xx生理盐水重复离心一次。弃去上清

液,再加入适量xx生理盐水,摇匀后于65℃水浴中加热30min,然后,于1000 r/min离

心5min, 取上清液并转入xx试管中,即为芽胞菌悬浮液,置于冰箱中保存,可使用一个

月。

3.4.2　试液制备：准确称取绞碎试样10g(xx至0.1g)于均质杯中,加入20mL甲醇,均质

2min后,移入离心管中,于3000 r/min离心20min。取其上清液15mL,转入盛有5mL蒸馏水

的250mL分液漏斗中,混合后加入10 mLxxxx,充分振摇,静置分层,放出xxxx层

于150 mL茄形瓶中。用xxxx再重复提取两次, 合并xxxx至上述茄形瓶中, 于50～

60℃水浴中用旋转蒸发器浓缩至干,加入0.5mL甲醇溶解残留物供TLC实验用。此样液中相

当于禽肉试样浓度为15g/mL。

3.4.3　测定

3.4.3.1 生物自显影

　　将每个样品及标准溶液分别点在四块薄层板上,先于每块薄层板下端2cm处划一条基

线,然后在这条基线上分别点20μL试液和3μg(效价)/mL莫能菌素标准溶液,试液和标准

溶液点相距2.5cm。在展开缸中用乙酸乙酯进行展开,直至溶剂前沿线距板顶端1.5cm处为

止,取出薄层板,风干后备培养用。

　　将薄层板水平置于高压xx的长方形培养皿中,无菌操作将已熔化并冷却至50～55℃

的生物自显影用培养基均匀地喷在其表面上,然后用10mL上述接种芽胞菌悬液的培养基铺

满整个薄层板,保持水平,待其凝固,于37±1℃培养18 h。

3.4.3.2　对照试验

　　除不加试样外,按上述测定步骤进行。

3.5　结果计算和表述

　　经过培养后,在薄层板上与莫能菌素标准液产生抑菌圈的Rf值(约0.38)相同位置上,

显现抑菌圈者即为阳性。

　　当样品判定为阳性时,测量四块薄层板上的试液及标准溶液产生的抑菌圈直径,分别

计算出平均值。当每组四个直径值的相对标准偏差(RSD)均不超过5%时,并且试液的抑菌

圈直径与标准溶液(20μL)的抑菌圈直径近似(直径相差不超过±1mm),则其样品中莫能菌

素含量按下式计算：

c

X＝──

m

式中：X——样品中莫能菌素的含量,mg/kg；

　　　c——试验中所用的标准溶液的浓度,μg/mL；

　　　m——最终试液所代表的禽肉试样的浓度,g/mL。

4　测定低限、回收率

4.1　测定低限

　　本方法测定低限为0.20mg(效价)/kg。

4.2　回收率

　　回收率的实验数据:莫能菌素浓度在0.20～0.67mg(效价)/kg范围内,回收率为81%～

{bfb}。

附　录 A　

　　　　　　　　　　　　　培养基成分及制备方法

　　　　　　　　　　　　　　　　 (补充件)

A1　菌种用培养基

　　　　　蛋白胨 10.0g

　　　　　牛肉浸膏 5.0g

　　　　　氯化钠　　　　　　　　　 2.5g

　　　　　琼脂 15.0g

　　　　　蒸馏水 1000mL

　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其

xx后pH为6.5±0.1,分装于试管或克氏瓶内,于121℃ 15min高压xx,xx后制备成

所需斜面备用。

A2　生物自显影用培养基

　　　　　蛋白胨 10.0g

　　　　　酵母浸膏　　　　　　　　 2.5g

　　　　　葡萄糖 10.0g

　　　　　琼脂 15.0g

　　　　　蒸馏水 1000mL

　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使其

xx后pH为6.0±0.1,分装于锥形瓶内,于121℃15 min高压xx,备用。

A3　肉汤培养基

　　　　　蛋白胨 10.0g

　　　　　牛肉浸膏　　　　　　　　 5.0g

　　　　　氯化钠　　　　　　　　　 2.5g

　　　　　蒸馏水 1000mL

　　将上述各成分于蒸馏水中加热溶解,用1mol/L氢氧化钠溶液或10%盐酸调节pH,使

其xx后pH为7.0±0.1,分装于试管中,于121℃15min高压xx。

附 录 B　

　　　　　　　　　　　　　　　　检验程序图

　　　　　　　　　　　　　　　　 (补充件)

试样(10.0g) 试验菌培养

┃ ┃

┃ 于均质杯内加入 ┃

┃ 20 mL甲醇 ┃

┃ ┃

均质2 min ┃

┃ 移入离心管 ┃

┃ ┃

离心20 min(3000r/min) 菌液制备

┃ ┃

取上清液(15 mL) ┃

┃ 转入盛有5mL蒸馏 生物自显影用培养基

┃ 水的分液漏斗中 ┃

┃ ┃

┃ ┃

加入xxxx(10 mL) ┃

┃ 充分振摇后分取xxxx层 ┃

┃ 转入茄形瓶中, 再重复两次 ┃

┃ ┃

合并入上述茄形瓶中 ┃

┃ ┃

　　 蒸干 ┃

┃ ┃

用0.5mL甲醇溶解 ┃

┃ ┃ 

层析 ┃ 

┃ ┃ 

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┃

培养 

┃

┃

检定

┃

┃

结果和表述 

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附加说明:

　　本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出。

　　本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草。

　　本标准主要起草人袁而森、王素琴、李剑影。

　　本标准等同采用日本厚生省检验方法：畜水产食品中の残留物质检查法(1990)。

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中华人民共和国国家进出口商品检验局1993-12-28批准 1994-05-01实施