分析一个样品，不是一拿来就试着用各种流动相来分离，而是首先要分析样品着手。是否为高分子化合物、粘度大、具有生物活性的生物分子、有些或全部的样品成分是否可电离(根据这样条件可选择色谱柱、流动相、柱温、流速、离子对试剂、是否需要预处理等等)...... 具体分析：首先应了解样品的溶解性质，判断样品分子量的大小以及可能存在的分子结构及分析特性，{zh1}再选择HPLC的分离模式，以完成对样品的分析。 样品的溶解度，由样品在有机溶剂中溶解度的大小，初步判断样品是非极性化合物还是极性化合物，若样品溶于非极性溶剂，表明样品为非极性化合物，通常可 以选吸附色谱法或正相分配色谱法、正相健合色谱法进行分析。苦样品溶于极性溶剂或相混溶的极性溶剂，表明样品为极性化合物，通常选用反相分配色谱法或更为 广泛应用的反相键合相色谱法进行分析。若样品溶于水相，可首先检查水溶液的pH值，若呈中性为非离子型组分，常可用反相 (或正相)键合相色谱法进行分析。若pH 呈弱酸性，可采用抑制样品电离的方法，在流动相中加入硫酸、磷酸调节pH=2～3，再用反相键合相色谱法进行分析。若pH呈弱碱性，则可向流动相中加入阳 离子型反离子，再用离子对色谱法进行分析。若pH呈强酸性或强碱性，则可用离子色谱法进行分析。由于除去固定相中的离子对试剂较慢，当改变流动相时，有时 需要长时间的平衡;再由于离子对试剂纯度问题，使离子对中的基线波动问题和干扰问题现象比较常见。 优化条件在于最终色谱图中能产生出最嗌分开的谱峰。了解化合物的化学结构，知道是否存在酸或碱，当流动相的pH值=混合物的平均pKa值或接近时,可 能会使分离较好。先优化K;随着容量因子的增加，谱峰会展宽，峰形变矮。(当所有谱峰符合1<20的范围时，其流动相已接近{zj0}了;再 Α(≥1.05);{zh1}优化N，不同微粒的柱子均有一个{zj0}流速，流速再高会降低N值;如果降低流速，则会增加工作时间，但分离度会更好。当流动相粘度增 加时，N值也将降低;因此尽可能使用低粘度的溶剂。用最小RS法，另加常识(数一下峰!)，在大多数情况下将是{zj0}方案。 推荐大家看看，个人觉得不错：《》《》 至于谱峰拖尾影响因素是很多的，可解决的办法有： 在缓冲不好或离子强度过低的分离中，也会出现保留值重现性差和峰拖尾。增加缓冲浓度(与样品大小相匹配)能大大改善此情况。 柱子变得严重拖尾，甚至出现双峰，通常是进口滤板发生了部分堵塞或柱进口处出现塌陷(可将空隙填满接着反相冲洗柱子)。柱子出现峰展宽、拖尾则标志着样 品中有保留性极强的“污物”在柱子的进口处堆集起来。样品在柱子上超载能引起峰展宽、拖尾(或伸舌)。通常减少进样量或提高检测器灵敏度。 早出的峰拖尾最甚是仪器存在柱外效应的{zh0}佐证。要排除柱外效应，这不用我来说了吧! 分析酸性或碱性组分，一般必须采用缓冲液流动相。流动相中无缓冲液，样品组分在柱内形成谱带的哪一部分会引起流动相 pH增加或降低，样品组分改变了电离程度，产生峰拖尾。缓冲液除了能改变峰形外，还能改变峰的保留。一般用中等偏高的浓度有利于减少峰拖尾 (0.05～0.1mol/L)。 如还拖尾的话可加适量的修正剂! |
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