Biodegradability of leathers through anaerobic pathway

K. Dhayalan a, N. Nishad Fathima a, A. Gnanamani b, J. Raghava Rao a,*,B. Unni Nair a, T. Ramasami a

a Chemical Laboratory, Central Leather Research Institute, Adyar, Chennai 600 020, India

b CHORD, Central Leather Research Institute, Adyar, Chennai 600 020, India

皮革通过厌氧途径的生物降解性

摘要

　　制革过程中产生了大量的液体和固体废物，固体废物尤其是鞣制后革废的治理是制革技术人员所面对的重要问题。因此，在皮革生物降解性的研究成为急切而重要的议题。在本论文中，鞣前皮、铬鞣革和植鞣革在厌氧环境下的生物降解性得到讨论，xxx的两种不同菌源已经用于皮革的生物降解。皮革在降解前，脱鞣作为前处理的影响也得到研究，并发现植鞣革比铬鞣革在生物降解过程中产生更多的气体物质。当混合xxx株作为接种物时能降解植鞣革的可溶性有机物，因此相比于用厌氧性活性污泥处理植鞣革在初始几天气体产生增加。对于铬鞣革，使用不同的两种菌源在气体产生量上并无太大变化。同时发现脱鞣有利于促进两种革的生物降解性。

　　1前言

　　在制革中清洁技术的运用明显降低了在制革过程中的污染，然而，因为鞣制后皮革的生物不降解性，在垃圾场中处理从制革、皮革服装制造部门，制鞋部门和废弃的皮革服装产生的固态皮革废物由于其不生物降解性而难以处理，使固废管理系统效率低下。在制革过程中，鞣制是一个鞣剂与胶原蛋白反应，使胶原蛋白质固定的过程，因此，皮革获得了对化学，热和微生物降解的抵抗力。铬鞣是最重要的鞣制方法，是用碱式硫酸铬作为鞣剂，可以获得质轻、价廉和高的热稳定性和化学抵抗力的革。而其他普遍运用的鞣剂则是基于植物单宁。原料皮的胶原分子与铬反应至少有三种方式，其中最重要的是铬分子与胶原蛋白共价交联赋予皮革以特殊性质，另外的相互作用包括铬与胶原蛋白的单点结合和铬在纤维间的填充。根据2003年Brown和Taylor的报告，仅有2%铬被简单吸附，这种铬对稳固性影响不大，大约7-10%铬贡献于稳固性即热固性，同时40%铬与胶原纤维相联，但未形成多点结合。

　　关于多酚物质（植物鞣剂）与胶原纤维的交联，多酚与蛋白相互作用的4种机制已经为公理，包括共价连接，离子键，氢键或疏水作用。根据2001年Bo et al的研究，植物鞣质与胶原蛋白分子的相互交联主要是由酰胺羰基氧与酚羟基之间的氢键构成（Hagerman和Klucler，1986）。脯氨酸是一种羰基氧与亚氨基氮相联的氨基酸，是很好的氢键接受体。因此胶原与多酚之间显示具有很强的氢键连接。又因为胶原分子的螺旋结构，从而提高了肽链对氢键交联的接受能力。稳定胶原纤维的氢键交联增加了鞣后革的变性温度（收缩温度）。

　　关于皮革的产量，欧洲占皮革生产总量的25%位居{dy}，每年产生大约17万吨鞣后革废，其中4.3万吨来自于制鞋部门。因此处理皮革废弃物尤其是鞣制后的废革是一个严重问题。如土埋，焚烧等传统方法有许多问题，并不适合废革的处理。在土埋的方法中，Cr3+因为酸雨从废革中流失到地下水系统中限制了该方法，而在焚烧过程中，Cr3+则有可能转变为Cr6+，而Cr6+具有毒性。由于废皮中含有0.21-0.7%的N，也必然导致NOx的排放，皮革中的N主要是以氨基酸形式存在。1993年Heidemann的研究，证明由于氨基酸的结构所决定，氨基酸的高温分解在850°C，丙氨酸和a-氨基丁酸是两种在热分解过程中xx转化为气体的氨基酸，而带有官能团的氨基酸会降低热分解效率，丝氨酸和赖氨酸只有60-70%分解。并且在焚烧过程中HCN和NH3的产生会造成大气污染，除了皮革中的N含量外，铬也会严重污染空气，在低焚烧温度下300-600°C，只要有少量的铝和碳酸盐存在，就会产生可溶性Cr6+。废皮废革在760-980°C和PH值6-9碱性条件下焚烧产生以Cr3+为主的灰烬。1989年Rei et al证明PH6.3-11.5灰烬中的Cr主要以3价形式存在，当PH>11.5时Cr主要以6价形式存在。废革的传统处理的两种方式都是不提倡的，因为这两种方法都不是在环境友好性方法下解决固体废料处理问题。因此，发展处理鞣后革固废的技术工作的重要性成为重中之重，另外，现在的管理要求从固态废料中获得能源，固体废料通过厌氧消解过程可重新获得化学能源和燃料能源，这种过程的主要优势有以下几点（1）随着生物气体的产生xx废物污染；（2）N的产物使废水营养化用于农业生产；（Gnanament和Kasturi Bsi,1992）这种运用低产量协同和低腐败的xx技术使该过程持续低污泥产生量，然而厌氧消解对于降低低分子量的酚和多酚化合物如丹宁和脂类效率低下。（Hamdi,1996;Borja et al,1995;Beccari et al,1996）他们致力于在消解过程中各种微生物的抑制作用（因此阻止消解生物）和在消解中释放的物质。根据1998年Borja et al的报告，一些生物和化学前处理方法可在厌氧消解过程中减少那些酚醛物质，尤其是丹宁的毒性。2002年Beccari et al通过观察获得更具前景的结论，添加具有降解低分子活性的微生物，其代谢产物可被厌氧生物进一步降解。因此，本项研究主要目的在于利用两种菌源对于鞣前皮，铬鞣革和植鞣革废料，及脱鞣铬鞣和植物鞣废料的生物降解技术的可行性。

　　2材料和方法

　　2.1材料

　　为了评估皮革废弃物的厌氧生物降解性，鞣前皮、铬鞣和植鞣革试样来自Chennai,India的皮革厂。

　　2.2厌氧xx菌种的提取

       从处理皮革厂废水的上层厌氧污泥层（UASB）和污水处理厂处理城市地下水的污泥中收集厌氧活性污泥，并从中提取xxx株。根据1996年Cappuccino和Sherman总结的标准程序提取生物菌落，使用牛心提取物,5g；胰蛋白，10g；NaCl，5g；蒸馏水，1000ml；PH7.3厌氧有机体的生长基于溶血。菌种的次代培养和纯培养主要在马肉琼脂媒介其中含有45%巯基乙酸盐。从制革污水和厌氧性消解污水污泥的厌氧性活性污泥中获得大约5种纯菌落，这些菌种命名为AO1-AO5。根据1994年终止菌技术（Determinative bacteriology）Bergy法的过程，这些菌种机体更易受格兰染色法的影响。

　　　2.3批量实验

　　　鞣革和鞣前皮样品（规格：0.3×0.3cm2）的生物降解性评估由批量实验测定。批量系统的一个特点是{dy}阶段和第二阶段间有个明显分界，{dy}阶段的酸化过程远快于第二阶段，第二阶段中的不稳定脂肪酸转变为气体。两个实验使用两种不同菌源。

2.3.1实验I

实验I 按照ASTM标准（2000），用厌氧消解关不经预处理的鞣前皮，铬鞣革和植鞣革样品。

2.3.1.1.使用厌氧活性泥

废水处理厂用于处理制革污水的厌氧性消解活性污泥含有活性厌氧环境，用于现在研究，测定活性泥在湿条件下的单位数/g（1994年xx计数的Bergy法），菌种的总有机固体含量为1-2%。试验样品为鞣前（UTLS）、铬鞣革（CTLS）、植鞣革（VTLS）样品。

空白试验：厌氧媒介+厌氧活性泥

对比试验1：UTLS+厌氧媒介

对比试验2：CTLS+厌氧媒介

对比试验3：VTLS+厌氧媒介

试验1：UTLS+厌氧媒介+厌氧活性泥

试验2：CTLS+厌氧媒介+厌氧活性泥

试验3：VTLS+厌氧媒介+厌氧活性泥

在添加含有厌氧活性泥的厌氧媒介到试验1.2.3之前，培养瓶中加入等重测试样本，并维持在厌氧环境中，所有试验都进行三次平行实验。

　　2.3.1.2.使用厌氧性活性污泥中提取的厌氧型微生物作为接种物

　　菌体AO1,AO2,AO3,AO4和AO5在巯基乙酸盐液体媒介中次代培养，96小时后，大约从每个培养基中大约提取10ml在厌氧条件下分配到带有1g测试样本的培养瓶中，估算AO1—AO5的单位数/ml，实验方案如下

　　空白试验：厌氧媒介+AO1—AO5各10ml

　　试验1：UTLS+厌氧媒介+AO1—AO5各10ml

　　试验2：CTLS+厌氧媒介+AO1—AO5各10ml

　　试验3：VTLS+厌氧媒介+AO1—AO5各10ml

　　实验2.3.1.1.的对比试验可作为实验2.3.1.2.的对比试验，所有实验都做三次平行实验。

　　2.3.2.实验II

　　实验II关于铬鞣革和植鞣革经前处理后的厌氧消解，前处理包含使用由Datta1973年总结的标准程序进行脱鞣。

　　实验方案与实验2.3.1.1.和2.3.1.2.相似，进行脱鞣后铬鞣和植鞣物质的生物降解性评估实验。

　　前处理步骤

　　根据1973年Datta的方法对铬鞣和植鞣革进行脱鞣，铬鞣革碎片中加入200%水，水中含有2%草酸和10mM EDTA，在振荡条件下室温处理2h，对于植鞣革，底物中加入{bfb}水，水中加入1.5%硼砂和0.5%硫酸钠进行处理，前处理后样本易使用厌氧活性泥和混合型xxx种进行厌氧消解。

　　500ml培养瓶中加入50g碎片加10%种液，用带有铝盖的丁基橡胶塞xx密封，用一针头注射器，针头插入培养瓶顶部，注射器的另一头连接软管，软管浸入含水的广口瓶的水中。因为厌氧消解产生的气体替换水，xx测量替换出的水量，实验时间是30天，30天后将实验瓶中的物质移除检测有机C（Allison,1982）和凯氏定N量（Bremner和Mulvaney）在不同时间间隔下测定分析不稳定脂肪酸（APHA，美国公共健康协会，2002）

　　3结果和讨论

　　皮革通过使用交联剂（如铬配合物和xx植物多酚）使动物皮中的蛋白质，胶原蛋白固定或鞣制生产而成。植鞣法是一种古老的鞣制方法，但铬鞣法是在1858年引进制革技术。鞣制剂赋予皮革高的收缩温度和化学稳定性的同时，当废革作为废物倾倒时鞣制剂也成为麻烦的东西，尤其是铬鞣革。在铬鞣革废处理时，Cr3+渗入到地下水中是一个重要问题。在温和条件下使用酶从削匀革屑中提取蛋白产品和生产出可循环铬的可能性研究已在从事（Taylor et al,2000,1998;Cabeza et al,1998）不论如何，革废（包括铬鞣和植鞣革）的治理方法也有望成功。因此，处理稳固物质是革废管理研究团体的首要重点难题，如在简介中解释，交联剂和其他填充剂的作用使皮革不能生物降解。这些交联的破坏是一个泛长的过程，厌氧消解作为一种可行和有保障的技术，对大多数有害和无害废弃物的处理提供了方法。因此，在本项工作中，尝试从废革堆中获取能源和对鞣革废物的处理和破坏提供方法的可能性正在从事。

在本项研究中，从处理皮革厂废水的上层厌氧污泥层（UASB）和从处理内部污水的传统厌氧反应器中收集的厌氧活性污泥中提取xxx种。厌氧活性污泥包含10¹¹-10¹²CFU/g。图1a和1b显示了两种菌落AO1和AO2（其他没有显示）的革兰氏染色特点。xxx种通过其在血液琼脂媒介中的溶血活性进行初步筛选。5种菌株均被测试为革兰氏阳性杆体。有机体AO1显示个体杆形为小型结构，但剩余4种菌体显示为以束状形式的杆链。鞭毛染色和孢子染色法对厌氧有机体中提取菌种更具效用。每种菌种表现的繁殖单位（CFU）的数量不同，xxxAO1，AO2,AO3,AO4和AO5分别含有10²，10⁴，10³，10⁶和10³CFU/ml。

     在分别使用两种菌源消解UTLS,CTLS,VTLS的气体产生量，在两次实验的对比样本在实验期间的最初两天时间内均无气体产生，然而实验样本则显示气体产生有一个缓慢增加。使用厌氧活性污泥消解鞣前皮样本，观察到在第6天每50g产生50ml混合气体（图2）。在恒温6天后鞣前皮被xx破坏，介质中不含有任何固体物质。在铬鞣和植鞣革样本中，气体产生的初始时间被延后，同时气体产生的含量也相比于鞣前皮样本观察到的气体产生量较少。当比较两种菌源的效率时，使用UASB活性污泥气体产生{zd0}量开始于20天，使用混合菌株气体产生开始于26天（图3a）。

    有趣的是当相同的接种源用于经前处理后或者脱鞣的CTLS样本，从消解的初始阶段开始气体产生曲线右移。另外，使用两种不同的接种菌源在气体产生中也观察到明显的不同，如图3b（插图）所示从UASB中接种的实验，气体产生呈正弦曲线，并在12，19，26和30天单天产气量为15-22ml的{zd0}值，然而使用混合菌株，气体增长较缓，并在12天有个大约20ml的{zd0}单天产气量，随后急剧下降，从25天开始再次持续上升。

   图4a和4b显示了两种菌源，VTLS和经前处理的VTLS的气体产生含量比值。有趣的是，使用混合菌株从开始阶段气体产生就有一个缓慢的增加，并在第8天达到峰值，并随后气体产生开始下降，直到实验结束（图4a），在使用UASB的活性污泥条件下气体产生缓慢增加，并在第21天观察到一个峰值，随后明显减少，但在经前处理后的VTLS，与单独VTLS观察的结果相似，仅仅混合菌株相比使用厌氧活性污泥效率不同，UASB在第10天观察到20ml单天产气量峰值，随后呈显出正弦图形，然而使用混合菌株，仅观察到10-12ml单天产气量峰值。

   对于本项研究，不论选择何种材料，观察气体产生，不稳定脂肪酸（VFA）显示了一个相似的图形，图5a和5b显示了分析对于CTLS和经前处理的CTLS的不稳定脂肪酸，直到第15天，不稳定脂肪酸均显示有一个积累。然后随着培养期的延长而下降。在对比样本中，在第6天VFA大约有148meq/l随后快速下降，并在第30天仅有20meq/l。对于单独使用两种菌源的测试样本，UASB活性污泥显示在第15天有120meq/l的增加，随后到第20天减少到50meq/l，相比于使用混合菌株第15天的大约130meq/l和第30天的大约125meq/l。对于经前处理的CTLS，比单CTLS观察VFA量的结果偏高，另外，两种菌源均在第7天达到约200-220meq/l的峰值，随后在15-30天为150-180meq/l。

   VTLS样本的稳定脂肪酸(VFA)分析，不论使用何种菌源，VTLS和经前处理的VTLS具有明显不同的VFA（图6a和6b），对于VTLS，在第15天，VFA积累到100-120meq/l，并在第30天上升到120-130meq/l，对于经前处理的VTLS，在第15天观察到大约200-230meq/l的峰值，在第30天观察到大约180-200meq/l，这清晰显示了前处理脱鞣的效果，前处理赋予脱鞣革比鞣后革更高的生物降解性。

   厌氧消解前后样本的C和N分析揭示了CTLS的TOC和TKN上分别有大约15.4%和12.7%的降低，前处理后CTLS相对的大约37.5%和28%的减少（表1），而VTLS样本显示了在TOC和TKN上大约12.6%和25%的减少，相对经前处理的VTLS大约31.5%和26.3%的降低，这些结果表明铬鞣革比植鞣革具有更高的生物降解性。

   CTLS及VTLS和前处理后CTLS及VTLS的收缩温度（Ts）的结果如下表2所示，CTLS和VTLS的对比样本收缩温度分别为110±2℃和88±1℃，经前处理后CTLS和VTLS的对比样本收缩温度分别为85±2℃和82±2℃，随着厌氧消解，CTLS和VTLS的收缩温度分别减少到82±1℃和84±1℃，而经前处理后CTLS和VTLS的收缩温度分别减少到75±1℃和78±1℃。

   从而可知，鞣制后物质的非生物反应性归因于鞣剂，相比于两种鞣制方法皮革的降解性，植鞣革降解产生的气体量微高于铬鞣革，这可能是归因于在培养过程中从植鞣革中释放出的可溶性有机物的降解可能性。据1973年Batta的报告，从植鞣革中释放的可溶性有机物包含较高比例的酚醛和丹宁。据Hamdi(1996),Borja et al（1995），Beccari et al(1996)的报告，酚醛和丹宁其自身不可降解性质，可能是阻止材料厌氧消解的主要化合物。然而在本项研究中，运用混合菌株接种能够降解植鞣革中的可溶性有机物，因此在最初的几天显示气体产生有一个增加水平相比于使用厌氧活性污泥接种。而对于铬鞣革，使用两种菌源对于气体产生并无影响。

   脱鞣样本的实验相比于未脱鞣样本在气体生成上有一个增加水平。另外，气体产生的量也与接种的菌源无关，在脱鞣过程中，铬鞣革大约有40%的鞣剂被去除，而植鞣革大约有60%的鞣剂被脱出。因此，如图3b和4b所证，因为物质更易降解从而导致气体产生水平的上升。对于铬鞣革和植鞣革，脱鞣过程的使用在媒介中甚至铬鞣革的生物可降解的可行性。前处理后的铬鞣革在第8天达到22ml峰值，另外在前处理后的CTLS直到实验结束，气体产生均有稳定增加。经前处理后CTLS相比于经前处理后的VTLS在TOC和TKN的减少比例更高，从而说明铬制剂的去除明显降低了皮革的稳固性，这在收缩温度观察的结果上得到了很好的反映，厌氧消解后经前处理后CTLS相比于经前处理后的VTLS的Ts收缩温度小。

   4结论

   评价非生物反应材料（如鞣后革废）的降解性研究为有效处理固体革废提供了解决方案。所有现有的解决方法都会多多少少以液体，气体及固体形式造成二次污染。本项研究是首次关于鞣后革废的降解，结果表明使用厌氧活性污泥降解铬鞣革废是可行的，并且铬鞣革废较植鞣革废更易生物降解。

   参考文献

Allison, L.E., 1965. Organic carbon. In: Black, C.A. (Ed.), Methods ofSoil Analysis, vol. 9. American Society for Agronomy, Madison, WI,pp. 1367–1389.

APHA American Public Health Association, 2002. Standard testing methods for industrial wastewaters, 17th ed.

ASTM Standards, 2000. D 5210-92 Standard test method for determining the anaerobic biodegradation of plastic materials in the presence of municipal sewage sludge. pp. 430–433.

Becari, M., Carcucci, G., Lanz, A., Majone, M., Papini, M.P., 2002.Removal of molecular weight fractions of phenolic compounds in an integrated treatments of olive oil mill effluents. Biodegradation 13,401–2410.

Beccari, M., Bonemazzi, F., Majone, M., Riccardi, C., 1996. Interaction between acidogenesis and metanogenesis in the anaerobic treatment of olive oil mill effluents. Water Research 30, 183–189.

Bergy’s Manual of Determinative Bacteriology, ninth ed., 1994. Williams and Wilkins, Baltimore, MD.

Bo, Han, Jason, Jaurequi, Bao, Wei Tang, Marcel, E. Nimni, 2001.Proanthocyanidin: a natural crosslinking reagent for stabilizing collagen matrices. Journal of Biomedical Materials Research Part A 65 (1), 118–124.

Borja, R., Alba, J., Garrido, S.E., Martinez, L., Garcia, M.P., Monteoliva,M., et al., 1995. Effect of aerobic pretreatment with Aspergillus terreus on the anaerobic digestion of olive-mill wastewater. Biotechnology and Applied Biochemistry 22, 233–246.

Borja, R., Banks, C.J., Wang, Z., Mancha, A., 1998. Anaerobic digestion of slaughter house wastewater using a combination sludge blanket and filter arrangement in a single reactor. Bioresource Technology 65, 125–133.

Bremner, J.M., Mulvaney, C.S., 1982. Nitrogen-total. In: Page, A.L.(Ed.), Methods of Soil Analysis: Part 2. Chemical and Microbiological properties, ASA Monograph Number, vol. 9. American Society for Agronomy, Madison, WI, pp. 595–624.

Brown, E.M., Taylor, M.M., 2003. Essential chromium?. JALCA (98) 408–412.

Cabeza, L.F., Taylor, M.M., Dimaio, G.L., Brown, E.M., Marmer, W.N.,1998. Processing of leather waste: pilot scale studies on chrome shavings. Part II. Purification of chrome cake and tanning trails.JALCA (93), 83–98.

Cappuccino, J.G., Sherman, N., 1996. Microbiology. A Laboratory

Manual, fourth ed. Addisson Wesley Publications, pp.

129–186.

Creighton, T.E., 1980. Multiple binding of antibodies to antigens:effect on radio immuno assay binding curves. Biochemistry 19,4308–4312.

Datta, S.S., 1973. An Introduction to the Principles of Leather Manufacture.Indian Leather Technologist Association, Lal Bazar, Calcutta.Gnanamani, A., Kasturi Bai, R., 1992. Influence of biodigested slurry on rice-gram cultivation. Bioresource Technology 41 (3),217–221.

Hagerman, A.E., 1980. Ph.D. Thesis, Purdue University, West Lafayette,IN, USA.

Hagerman, A.E., Butler, L.G., 1981. The specificity of proanthocyanidin–protein interactions. Journal of Biological Chemistry 256 (9), 4494–4497.

Hagerman, A.E., Klucher, K.M., 1986. Tannin–protein interactions.Progress in Clinical Biology Research 213, 67–76.

Hamdi, M., 1996. Anaerobic digestion of olive mill wastewaters. Process Biochemistry 31, 105–110.

Heidemann, E., 1993. Fundamentals of Leather Manufacturing, first ed.Eduard Rorther KG Druckerei und Verlag, Darmstadt.

Loomis, W.D., 1974. Overcoming problems of phenolics and quinines in the isolation of plant enzymes and organelles. Methods in Enzymology 31 (Pt), 528–544.

Pierpoint, W.S., 1969.O-Quinones formed in plant extracts. Their reactions with amino acids and peptides. Biochemistry Journal 112 (5), 609–616.

Rai, D., Eary, L.E., Zachara, J.M., 1989. Environmental chemistry of chromium. The Science of the Total Environment 86, 15–23

Taylor, M.M., Cabeza, L.F., Dimaio, G.L., Brown, E.M., Marmer, W.N.,1998. Processing of leather waste: pilot scale studies on chrome shavings. Part I. Isolation and characterization of protein products and separation of chrome cake. JALCA (93), 61–82.

Taylor, M.M., Cabeza, L.F., Marmer, W.N., Brown, E.M., 2000. Use of Tryptec enzyme preparation in treatment of chrome shavings. JALCA (95), 243–252.