损伤时间推断研究进展 损伤时间的推断一直是法医病理学研究的重要课题之一。损伤时间推断有两个重要内容，一是生前受伤与死后伤的鉴别，二是伤后存活时间的推断。准确推断损伤时间对于重建案件，划定嫌疑人的条件，提供司法证据均有帮助。近年来随着各学科科学技术飞速发展与相互渗透，法医病理学研究也进入了一个快速发展时期。法医病理学研究从传统的组织病理形态研究发展到超微以及分子水平。本文拟对有关损伤时间推断的研究方法及进展作一综述。 1 研究方法 1. 1 肉眼检查 肉眼检查由于简便至今仍是鉴别生前伤与死后伤以及估计损伤经过时间的重要方法之一。肉眼检查主要观察有无出血，创口特征，炎症反应等。由于濒死期损伤时生活反应不明显，仅凭肉眼观察难以作出准确判断。 1. 2 显微镜检查与酶组织化学检查 一般而言，光镜检查较之肉眼观察更容易找出生活反应的证据。但是外伤后，生活反应的出现有一个过程，如果外伤后存活时间不超过4 小时者镜下无明显的炎症改变，因此，光镜检查也难以正确判断。酶组织化学检查通过检查创口区酶的活性而鉴别生前伤与死后伤。早在上个世纪60 年代，研究人员发现生前伤创口边缘一些酶活性升高，而死后伤以及坏死或变性的组织中酶活性不升高。而且酶活性的变化在伤后很短的一段内就可以被检测到。这些酶主要有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、芳基氨肽酶、酯酶以及腺苷三磷酸酶等。酯酶在动物伤后10 分钟就开始升高，而酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、亮氨酸氨基肽酶分别在伤后1 小时、3 小时就开始升高。此法使鉴别有无生活反应的时间提前到1 小时水平。但是由于酶的活性受到许多因素影响：例如死者的年龄因素，年长者酶的活性升高幅度低于年轻者；损伤的类型，如xx与机械性损伤中酶活性的改变及顺序均有不同，因而在法医实践中必须考虑这些因素，方能作出正确判断。近十多年来有人[1 ] 测定了生前伤者创口的RNA、DNA 以及核酸水平，发现伤后10 小时内有RNA 合成的持续增加，DNA 在伤后20 小时内合成持续增加，但核酸水平在尸体组织持续增加。此外有人[2 ]还测定了创口组织中一些非酶因子如补体C3 ，纤维蛋白，免疫球蛋白IgG、IgA、IgM，白蛋白，胶原等作为生活反应的标志物，发现补体C3 ，α1 抗糜蛋白酶IgG、IgA、IgM在伤后10 分钟升高；纤维蛋白自伤后直至死亡后7 小时一直形成，扫描电镜发现[3 ]受伤后5～10 秒已开始有纤维蛋白形成，随着时间延长，纤维蛋白形成稠密的网状。而死后损伤不见纤维蛋白网的形成，且纤维蛋白即使在迅速腐败的尸体（如夏季）上仍能存活3～4 天才被xx分解。水中尸体纤维蛋白可保存4～7 天。冷藏的尸体，纤维蛋白网更可长期保存。白蛋白于生前受伤后1 分钟开始升高至伤后6小时达到高峰，且峰值持续到18 小时。将创口组织块室温保湿情况下保存7 天，其中的白蛋白含量无明显改变。值得注意的是尸斑部位非损伤组织中的白蛋白含量也很高。如果尸斑部位与损伤部位重叠，则此法结果不可靠。此外蛋白酶抑制剂如α1 抗胰蛋白，抗凝血酶Ⅲ，α2 - 巨球蛋白，蛋白C等也成功地作为观察创口有无生活反应的标志物。 1. 3 生物化学检查 生物化学检查主要是检测一些炎症有关的介质如游离组织胺，5 - 羟色胺，儿茶酚胺，前列腺素，D - 二聚体以及电解质等。 1. 3. 1 组织胺与5 - 羟色胺 组织胺与5 - 羟色胺都是众所周知的参与早期炎症反应的介质。组织胺与炎症反应时的血管改变有关，5 - 羟色胺则出现于炎性渗出液中。在许多情况下两者同时释放出 1. 3. 2 儿茶酚胺类 近年来有人[5 ] 采用HPLC 方法测定了受伤组织中去甲肾上腺素，3 ，4 - 二羟基苯基乙酸以及5 羟基吲哚乙酸，发现对鉴别生前伤与死后伤均有较高的价值。此外Penttilac[6 ]采用荧光分光光度法检测儿茶酚胺类物质，证实儿茶酚胺类物质从受伤开始产生直至一小时内，可以用于损伤经过时间的推定。遗憾的是在个体死亡8～16 小时后，此种荧光消失，难以检测。 1. 3. 3 前列腺素 前列腺素是花生四烯酸的代谢产物，由受伤的细胞释放的一类具有血管活性的炎症性介质。动物实验[7 ] 发现6 -酮- PGF～1α在生前切创检材中含量随着伤后时间的延长而逐渐升高，至伤后3 小时达{zg}点，3 小时后逐渐下降。Lasarov[8 ]等采用放射免疫法联合气相色谱- 质谱仪观察到在动物生前创口组织中发现伤后10～60 分钟所有动物的PGF2b持续升高，显著超过死后损伤组织中的PGF2b含量。但是人体组织中未发现相应的PGF2b的改变，并认为PGF2b不宜作为鉴别生前伤与死后伤的标志物。而PGF2 测定结果显示出很大的变异，而且死亡时间对结果也有很大影响，因而对PGF2 的结果应慎重分析。 1. 3. 4 金属离子 对损伤时间推断有帮助的金属离子主要有K+ ，Na + ，Ca2 + ，Mg2 + ，Cu2 + ，Zn2 + ， Fe2 + 等。Lorente[9 ] 等研究了K+ ，Na + ，Ca2 + ，Mg2 + ，Cu2 + ，Zn2 + ，Fe2 + 在生前伤与死后伤中这些离子的变化并与组织胺，5 - 羟色胺作了比较，认为金属离子测定尤其是Ca2 + 在损伤的早期阶段而Mg2 + 对较晚阶段（大于6 小时）对于生活反应鉴别以及损伤经过时间推定均有帮助作用。 1. 3. 5 D - 二聚体 D - 二聚体是纤维蛋白代谢中的中间产物，构成纤维蛋白的抗原决定族，仅见于交联的纤维蛋白网形成之后，随后被血浆酶分解。有人[10 ] 用ELISA 方法检测了切创，擦伤与挫伤组织中D - 二聚体含量，发现D - 二聚体有助于判别切创的生活反应。因为100 %的切创组织中D - 二聚体含量升高且发生在伤后5 分钟直至死亡。 1. 4 免疫组织化学法与分子生物学方法 采用免疫组织化学法与分子生物学方法检测创口组织中的蛋白或细胞因子用于损伤时间推断是近年来法医学界积极探索的热点。目前用于损伤时间推断的蛋白或细胞因子主要有：胶质原纤维酸性蛋（GFAP），波形蛋白（VIM），蛋白tenascin ，S - 100 蛋白，热休克蛋白70 （HSP70），神经丝蛋白（NF），c - fos 蛋白，c - jun 蛋白，脑源性神经营养因子（BDNF）及其受体TrKB 蛋白，β- 淀粉样前体蛋白（β- APP），纤维连接蛋白特殊结构域片段（E ⅢA - FN），细胞因子包括IL - 1β，IL - 6 ，IL - 8 ，TNFα等。 1. 4. 1 GFAP ，VIM，tenascin GFAP 是星形胶质细胞特异性标志蛋白，VIM 属于中间丝蛋白，是间叶组织共同的标记物。Tenascin 则是细胞外基质蛋白。它们在脑损伤时均可表达。Hausmann[11 ] 观察到GFAP 阳性细胞数在脑外伤后1 天直至4 周显著增加；波形蛋白（VIM）在伤后22 小时表达增加；蛋白tenascin 在伤后7天表达增加。 1. 4. 2 S - 100 蛋白 S - 100 蛋白是胶质细胞特异性标志物，有人[12 ] 发现在正常大脑皮质和白质内S -100 蛋白阳性细胞以圆形无突起的胶质细胞为主。脑挫伤后2 天S - 100 蛋白阳性胶质细胞的胞体开始增大，但突起不明显。随着损伤时间的延长，胞体增大，突起变明显。伤后5 天达到高峰，在挫伤灶周围可见大量胞体肥大、突起明显的S - 100 蛋白阳性胶质细胞。这一结果表明S - 100 蛋白的变化可用于挫伤后时间的判断。 1. 4. 3 HSP70 ，NF HSP70s 是热休克基因家族中的一员，分子量在66～78KD 之间。HSP 的功能主要是维持细胞内蛋白自稳，提高细胞对应激反应的耐受性。NF 是神经元特有的细胞骨架成分之一，对维持神经元的形态、结构及生理功能都具有重要意义。据Northern 分析并经RT- PCR 证实，在正常大鼠大脑含少量HSP70 mRNA ，当脑发生局灶性缺血或外伤时HSP70s表达明显增加。在脑外伤模型中，HSP70s 表达明显增加发生在伤后30 分钟并局限于挫伤灶周围，12～24 小时后逐渐消失[13 ] 。死后脑挫伤灶周围无HSP70s 表达。NF 在伤后30分钟也可检测到，伤后1～3 小时NF 在挫伤灶周围的神经元胞浆内堆积，6 小时仍可见神经元胞浆内有NF 阳性着色。12 小时后NF 阳性着色的神经元开始减少。以上结果表明，HSP70 和NF 即可作为脑挫伤早期时间推断依据，同时也可作为判断生前伤与死后伤的重要标志。 1. 4. 4 c - fos 蛋白，c - jun 蛋白 c - fos 是一种即刻早期快反应基因，在正常成年xxxx细胞内处于检测不到的低水平表达。在受到刺激时能对各种刺激迅速作出反应。脑挫伤后1 小时c - fos mRNA 表达升高，3～8 小时消失[14 ] 。免疫组织化学法显示c - fos 阳性标记细胞在伤后1 小时出现，4 小时消失。Raghupathi[15 ]等运用液压冲击伤动物模型中发现，伤后5 分钟即可检测到c -fos mRNA ，c - jun mRNA 并于伤后6 小时恢复到正常水平。c- fos mRNA 在伤侧皮质和双侧海马表达，而c - jun mRNA 则xx于海马区表达。 1. 4. 5 BDNF 及其受体TrKB BDNF 属于神经营养因子家族成员之一，其基本功能是支持培养的感觉神经元的存活，分布于皮质、海马等处的胆碱能和多巴胺能神经元，BDNF 作为脑损伤后表达的一种慢反应基因，可能参与了神经细胞的损伤后修复。有人[16 ] 用大鼠液压冲击脑损伤模型中发现，正常及手术对照组大鼠脑组织表达少量的BDNF 及TrKB ；脑损伤后1 小时大脑皮质颗粒和锥体细胞、海马CA3 及小脑Purkinje 细胞表达增强，3小时达高峰，维持较高水平，12 小时开始下降，24 小时后降至对照水平。认为其时序性改变有助于法医学脑损伤时间推断。 1. 4. 6 β- APP β- APP 曾用作早期诊断弥漫性脑损伤（DBI）的蛋白指标。在神经细胞受到外界损伤因素刺激时，胞浆β- APP 含量显著增加，并以前体蛋白及多种裂解产物的形式在神经组织的发育、损伤修复中发挥重要作用。有人[17 ] 采用免疫组织化学法研究大鼠弥漫性脑损伤中β- APP 含量，发现DBI伤后30 分钟～1 小时神经元胞浆β- APP 免疫信号增强，伤后1 小时～12 小时，β- APP 含量显著大于对照组，但是随时间的变化而呈波动趋势，不同部位的时间变化规律不一致，提示β- APP 的变化在推断弥漫性脑损伤时间方面价值不大，但由于β- APP 可对损伤刺激发生灵敏的反应，这一特性可作为检测脑损伤的生物学指标。 1. 4. 7 E ⅢA - FN 纤维连接蛋白（FN）不仅是参与损伤修复的重要蛋白质，而且伤区组织细胞分泌的细胞型纤维连接蛋白还可发生剪接方式变化，表达出正常组织中没有的特殊结构域片段。这一特性在生前伤与死后伤的判别上极具优势。有人[18 ]等采用RT- PCR 技术在研究大鼠皮肤挫伤模型中发现，大鼠皮肤损伤后1 小时表达出正常组织中没有的E ⅢA 片段，在伤后24 小时内，随损伤时间延长其条带亮度相应升高。这一结果提示检测E ⅢA 片段是鉴别生前伤与死后伤的理想指标。 1. 4. 8 细胞因子 Fan[19 ]等应用Northern 斑点杂交技术研究大鼠液压冲击伤模型中发现，伤后1 小时在伤侧皮层及同侧海马有非常显著的IL - 1β和TNF - α的mRNA 表达一直持续到伤后6 小时。另外，伤后1 小时还可于损伤对侧的皮质及海马中检测到TNF -αmRNA 表达，24 小时后下降。另有人[20 ]在研究大鼠脑落体伤后发现，伤后3 天可以在伤侧大脑皮层检测到4 倍于正常水平的神经生长因子（NGF），此后又逐渐下降；Taupin[21 ]等在大鼠液压冲击伤模型中发现，伤后IL - 6 水平在伤侧皮层快速增加，并于伤后8 小时达到高峰，18 小时后开始下降。Holmin 等的研究发现，伤后4 小时可以在脑挫伤区周围单核细胞内检测到大量的IL - 1β，IL - 6 ，TNF - αmR2NA 表达，并且通过免疫组化双标记技术证实了上述结果。此外有人[22 ]在研究大鼠液压冲击伤模型中发现，正常大鼠脑组织有低水平的转化生长因子(TGF - β1) 蛋白表达，TGF-β1 在伤后1～3 天大脑皮质和脑干TGF - β1 蛋白表达逐渐增加，7 天时仍维持高水平；认为其时序性改变可望用于脑损伤时间推断。 2 存在的问题与展望 目前法医病理学家们虽然通过肉眼或光镜检查能解决多数案件的损伤时间推断问题，但有时仍需要其他的包括生物化学方法，免疫组化或分子生物学等方法加以解决。前述的许多标志物虽然在损伤时间推断上减少了不确定期，取得了可喜的成果，但这些研究多集中于动物模型，需要更多的人体材料研究并在法医实际检案中验证。现代分子生物学的方法为法医病理学提供了崭新的研究手段，为深入认识组织损伤修复中的一系列病理生理机制提供了强有力的工具，并为进一步寻找在损伤时间推断上有帮助的标志物提供依据。虽然有研究提示检测创口中某些mRNA 水平有助于鉴别生前伤与死后伤，但由于RNA 极易降解，能否用于法医实际检案还值得进一步研究。总之，随着研究的不断深入和认识的不断深化，损伤时间的推断将更加准确可靠。 参 考 文 献 1. Oehmichen M, Lagodka T. Time - dependent RNA synthesis |
