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【摘要】 目的 观察吡咯喹啉醌(PQQ)对大鼠海马神经细胞结构的影响。方法 侧脑室注射PQQ，50 d后行脑组织切片进行HE染色和尼氏染色，观察海马组织的形态学变化,用免疫组化法观察胆碱乙酰基转移酶的表达。结果 与对照组相比，PQQ处理后，大鼠海马神经细胞胞体和核增大，神经细胞密度增强，尼氏小体光密度值增加，此变化呈剂量依赖性；过大剂量的PQQ处理后，海马神经元的胞体和核变小，细胞的凋亡率增高；PQQ刺激胆碱乙酰基转移酶的表达。结论 PQQ能促进大鼠海马神经细胞的生长发育，但PQQ剂量过大可引起神经毒性作用。
基金项目：湖北省教育厅重点项目（2003A011）郧阳医学院优秀中青年科技创新团队(2005CXG01)
Change of the hippocampal tissue of rat induced by PQQ administered into the rat lateral intracerbroventricle
XIONG Shun-Hua，GUO Qing-Ping，WANG Yan，et al.
Department of Physiology,Yunyang Medical College,Shiyan 442000，Hubei,China
【Abstract】 Objective To investigate the effects of pyrroloquinoline quinone （PQQ） on the hippocampal tissue.Methods PQQ was administered into the rat lateral intracerebroventricle.After 50 days the metamorphosis of hippocampal tissue was observed by HE and Nissl′s staining.The protein expression of choline acetyltransferase (CHAT) were detected by immunohistochemical staining.Results Compared with the control group，the size of the neurosoma and nucleus，the optical density of Nissl′s and the density of neuro cells were increased markedly in lower concentration PQQ groups；the size of the neurosoma and nucelus were changed smaller，the apoptosis cells were increased markedly in high concentration PQQ group.PQQ could improve the expression of CHAT protein.Conclusions PQQ could impove the growth and development of hippocampal neurons in vivo.
【Key words】 Pyrroloquinoline quinone （PQQ）；Hippocampal neurons；Metamorphosis
吡咯喹啉醌（PQQ）及其家族成员被认为不同于尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和核黄素二磷酸腺苷(FAD)的维生素类物质，它是一种氧化还原酶辅基，作为电子的供体和受体参与机体氧化还原反应及xx呼吸链的电子传递过程；以PQQ及其家族成员为辅基的酶蛋白称为醌蛋白，目前已发现二十多种醌蛋白，如醇脱氢酶、葡萄糖脱氢酶、氨基酸氧化酶等〔1，2〕；植物、动物体内存在PQQ和醌蛋白，人体组织和体液中也存在微量PQQ。PQQ还具有一些重要的生物活性和功能，如刺激微生物、人体细胞生长和植物发育〔3〕；PQQ影响鼠肝脏线粒体成分的含量和功能，影响糖和氨基酸的代谢〔4〕，PQQ及其衍生物刺激离体培养的神经细胞、神经胶质细胞和活体鼠脑合成和释放神经生长因子，以促进神经细胞的生长和存活。离体条件下，PQQ连接于淀粉纤维上，防止神经淀粉纤维瘢痕的形成〔5〕。在体条件下PQQ能降低由D-半乳糖所致的神经毒性作用，延缓由D-半乳糖引起的鼠海马神经细胞衰老〔6〕。在体条件下它对神经系统的作用有待于深入探讨。本研究侧脑室注射PQQ，观察PQQ对大鼠海马神经组织的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 PQQ（Sigma公司）以生理盐水溶解，兔源的抗CHAT（武汉博士德公司），羊抗兔二抗（北京中杉金桥），1月龄雄性的Wistar大鼠32只（郧阳医学院动物中心提供）。
1.2 实验分组 将1月龄雄性的Wistar大鼠32只，随机分为4组，每组8只，①正常对照组：侧脑室注射生理盐水20 μl，每10 d一次。②侧脑室注射小剂量PQQ组：侧脑室注射PQQ 10-5mol/L 20 μl，每10 d一次；③侧脑室注射中剂量PQQ组：侧脑室注射PQQ 10-4mol/L 20 μl，每10 d一次。④侧脑室注射大剂量PQQ组:侧脑室注射PQQ 3×10-3mol/L 20 μl，每10 d一次。
1.3 海马组织切片的制作 取用药后50 d的xxxx醉后经左心室灌注生理盐水和4%多聚甲醛，断头取脑，置于固定液中固定，石腊包埋，连续石腊切片，切片厚度8 μm，二甲苯脱腊，行HE染色和尼氏染色观察海马组织的形态学变化 ，用Leica-Q500ZW彩色图像分析系统测定海马大锥体细胞胞体的长径、核的直径和胞浆中尼氏小体的积分光度值，每组随机测量50个神经细胞；测海马组织CA3区神经细胞的密度。
1.4 免疫组化分析CHAT蛋白的表达 取切片厚度8 μm的石腊切片，二甲苯脱腊，加兔源的抗CHAT抗体（1∶50）4℃孵育过夜，滴加羊抗兔IgG 30 min，DAB显色，苏木素复染。
1.5 统计学处理 数据采用x±s表示进行t检验。
2 结果
2.1 海马组织的形态变化 与对照组相比，PQQ处理组海马组织CA1、CA2、CA3、CA4和齿状回的厚度显著增加，尼氏小体染色更蓝，且与PQQ剂量呈正比。见图1。
2.2 海马神经细胞的形态变化 镜下观察，各组神经元呈圆形或多角形，并伸出多个突起，核大、中间可见核仁；与对照组相比，侧脑室注射PQQ（10-5和10-4mol/L）后，神经细胞的密度增强，细胞胞体和核变大，突起数目多于对照组，尼氏小体光密度值增加；此作用与PQQ剂量呈正比；但侧脑室注射PQQ3×10-3mol/L PQQ组，神经细胞的胞体和核反而变小，其间见多个核变浓密深染、核固缩、凝聚呈凋亡状。见表1和图2。
2.3 免疫组化分析海马组织胆碱乙酰基转移酶的表达 图3可见，对照组海马组织切片可见少量的黄色免疫反应物，而PQQ处理组海马组织可见免疫反应物呈棕黄色密集于细胞胞浆中和神经纤维中，特别多见于神经纤维中。
表1 海马神经细胞的结构变化（略）
与对照组相比：1）P＜0.05，2）P＜0.001
对照组 PQQ中剂量组 PQQ大剂量组
图1 尼氏染色观察海马组织的形态结构变化（×40）（略）
对照组 PQQ中剂量组 PQQ小剂量组
图2 HE染色观察海马CA2区大锥体细胞的形态结构变化（×400）（略）
对照组 PQQ中剂量组
图3 免疫组化分析海马组织胆碱乙酰基转移酶的表达（×100）（略）
3 讨论
已有资料报道，低浓度PQQ（3～30 nmol/L）能刺激培养的人成纤维细胞DNA合成，细胞的密度增加，其促生长作用强于成纤维细胞生长因子和胰岛素样生长因子，与上皮细胞生长因子相当〔7〕；已报道，PQQ能促进离体培养的皮层神经细胞的生长发育，增加其存活率，延长存活时间〔8〕。本研究显示，侧脑室注射PQQ后海马各个区的厚度增加，海马神经细胞密度、体积大于对照组，提示PQQ具有可促进在体的海马神经细胞生长发育的作用。PQQ处理组尼氏小体的光密度值显著高于对照组，说明PQQ处理组内神经元蛋白质的合成机能旺盛，细胞的代谢增强。已有资料报道，PQQ防止哺乳动物细胞线粒体的氧化损伤，防止呼吸链的非xx状态，而促进线粒体的生物氧化〔9〕；PQQ可增加线粒体mtDNA的含量，增强细胞色素C的活力，促进机体的代谢作用〔4〕。PQQ能促进培养的神经细胞和神经胶质细胞以及活体鼠脑合成和释放神经生长因子，而神经生长因子作为营养因子对神经元胞体和突起的生长、存活、功能的维持发挥营养作用。神经生长因子能促进胆碱能神经元表达胆碱乙酰基转移酶；图3示，PQQ处理后神经元和神经纤维的胆碱乙酰基转移酶的表达增强，胆碱乙酰基转移酶促胆碱能神经元合成乙酰胆碱，促进胆碱能神经元突触传递功能，而促进机体的学习与记忆功能；PQQ是否有直接刺激胆碱乙酰基转移酶的表达有待于进一步的探讨。
图2结果显示，应用大剂量的PQQ(3×10-3mol/L)后，海马组织增厚和细胞的密度增加，但神经细胞胞体的体积和核反而变小，且见多个凋亡的细胞，提示PQQ浓度过高对神经细胞产生毒性作用。有资料报道，过高浓度PQQ（大于300 μmol/L）则抑制DNA的合成，引起细胞死亡〔7〕。在氧化还原循环体系中PQQ能够产生O2和·OH，同时PQQ具有很强的xx自由基能力。PQQ作用于鼠皮质神经元N-甲酰-D-天冬氨酸盐（NMDA）受体，抑制由NMDA作用于NMDA受体xx的内向电流；在离体培养的鼠皮层神经元上，PQQ作用于NMDA受体的氧化还原调节位点，抑制由谷氨酸引起的自由基产生。但它抑制谷氨酸脱羧酶活性，抑制GABA的合成；因些它被认为是具有“两面性”的分子。PQQ作为新的维生素受到人们的关注，其营养性和药理学作用有待于进一步的探讨。
【参考文献】
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