缺血修饰白蛋白——新的心肌缺血生化标志物
急性冠状动脉综合征（acute coronary syndrome，ACS）是由于急性心肌缺血导致胸部不适和其他症状的一大类病症，是临床上常见的心脏、血管急症，也是造成急性死亡的主要原因。在美国，每年有800万非外伤胸痛患者就诊，而目前基本的临床工作如病史，体检及心电图（electrocardiogram，ECG）用作ACS的诊断其敏感性和特异性有限，以致2%~5%的心肌梗死（myocardial infarction，MI）患者由于疏忽而被遗漏；另外，有50%以上住院观察评价胸痛的患者，最终的诊断却不是ACS，这样导致了因xx不当而引起医疗纠纷，因此，临床医务人员努力寻找准确、快速而有用的生化指标来评价、诊断ACS。当从急症患者的血清中寻找生化诊断标志物时，Bar-Or等发现来自几个ACS（不稳定、心绞痛或MI早期）患者血清中，其白蛋白结合外源性钴Co2+的能力降低，后来证实这种白蛋白与心肌缺血密切相关，这种因心肌局部缺血而改变的白蛋白，称之为缺血修饰白蛋白（ischemia modified albumin，IMA）。
急性冠脉综合征和心肌缺血理想的生化标志物
ACS是20世纪80年代后期在缺血性心脏病的病理学研究基础上提出的概念。从临床角度观察，ACS涵盖了一组连续进展的病症，包括不稳定性心绞痛（unstable angina，UA）、非ST段升高的心肌梗死（non-ST segment elevation myocardial infarction，NSTEMI）、ST段升高的心肌梗死（STEMI）和心源性猝死。ACS的病理基础是冠状动脉内不稳定斑块形成血栓，临床上很多患者会发展到MI，甚至心脏猝死。斑块稳定的患者在临床上表现为稳定性心绞痛，而不稳定性斑块或斑块破裂时则表现为ACS。它是威胁人类生命的主要病症之一，被称为威胁人类健康的“{dy}杀手”。心肌缺血是ACS最常见的发病原因，临床上往往有相当一部分症状隐匿的患者被漏诊而未入院xx，这些漏诊患者实际上是心肌缺血患者，其死亡危险性比住院者高1倍。心肌缺血的临床表现常常是模糊而多样的，症状可能包括胸痛（绞痛）、上腹部和臂部不适、喘气、恶性和呕吐。然而，这些症状可能难以捉摸且不易识别，因此，寻找一种既经济快速又准确灵敏的心肌缺血早期生化诊断指标，具有非常重要的意义。
ECG对于AMI和UA有较高的特异性，但灵敏度低于50%，ACS患者来急症室就诊时，大约一半ECG是正常的。超声心动检查的应用因存在非缺血性室壁运动异常而受到限制，核素显像也有在损伤心肌>10g时才能检出,且该检查成本较高难以普及.心肌肌钙蛋白:心肌肌钙蛋白T(cardiac troponinT,cTnT)和心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI),肌酸激酶同工酶MB(CK-M是特异的心肌标志物,但仅在不可逆的细胞损害以及细胞膜的完整性被破坏之后,在血中才升高,短期和可逆的缺血发作,不会导致这些标志物血中水平升高,因此,传统的检查方法都不能作为诊断心肌缺血的“金标准”.临床工作者一直在致力于寻找一种灵敏的心肌缺血的理想生化标志物,能在ACS早期可逆阶段检出,从而有助于急性缺血患者的正确诊断和及时xx.
Morrow等指出,反映心肌缺血的理想标志物应具有如下特征: (1)最重要的是灵敏度和特异性均高,必须能检测出心肌缺血,在炎症及其他器官损伤期间或健康人中均不增高;(2)心肌缺血期间应能早期检出,心肌缺血迅速增高,与心肌受累范围呈比例增加;(3)在循环中稳定性好,可保持一个能连续检测的足够维持时间,提供一个合适的诊断时间窗口;(4)24h内血中浓度恢复至基础水平,以便能检测复发性缺血;(5)检测方法简便,检测时间短,周转时间(turn around time,TAT)应为30~60min或更短;具有可靠的分析特性,精密度良好(CV值低);(7)检测费用经济合理,IMA是近年来研究较多的心肌缺血检测项目,具备理想标志物的特征,临床可用于对急性心肌缺血的早期诊断,ACS的排除诊断及ACS危险性分层评价,具有重要意义.
IMA的发现和形成机制
IMA也称钴结合白蛋白(alumin cobalt binding,AC,早在上世纪90年代初,一名急症医xx现心肌缺血发作时,人血清白蛋白(human serum albumin,HAS)的化学性质可能会发生改变,同时发现HAS和过滤金属元素(如Co、Cu和Ni)有很强的结合能力。Bar-Or等首先报告急性冠脉综合征患者血清白蛋白结合外源性钴（Co2+）的能力降低，利用白蛋白-钴结合试验测定IMA，并用于检测心肌缺血。
IMA的形成可能与N-末端N-Asp-Ala-His-Lys片段变化有关，N-末端的变化可能与自由基的产生、氧张力下降、酸血症及细胞改变，如钠-钙泵功能紊乱和游离铜离子（Cu2+）增多待因素有关。其可能机制为：由各种原因引起缺血时，局部血液灌注和供氧减少，组织细胞进行无氧代谢，消耗ATP，代谢产物（如乳酸）堆积，使局部微环境pH值下降，导致Cu2+从循环蛋白的金属结合位点释放。在还原剂（如维生素C）存在时，Cu2+被转化为Cu+，后者可与氧化反应生成超氧阴离子（O- 2 ），在超氧化物歧化酶的作用下将其转化为过氧化氢（H2O2）和氧。H2O2在正常情况下是无害的，可由过氧化物酶降解成水和氧气，当有金属离子存在时，H2O2可通过Fenton反应形成具有高度活性的烃自由基（OH），致使蛋白质、核酸损伤和脂质过氧化。HAS易受烃自由基损害，使N-末端序列的2~3个氨基酸发生改变，从而形成IMA，所有这些反应在急性缺血后数分钟内即可发生，使得IMA在缺血后数分钟内迅速升高。Bar-Or等模拟人血清蛋白N-末端改变，研究缺血引起的白蛋白对CO2+结合位置的修饰，证实了N-末端3个氨基酸即天门冬氨酸-丙氨酸-组氨酸（Asp-Ala-His）对牢固结合Co2+是主要的，它通过N-乙酰化的方式删除一个或多个氨基酸，使白蛋白N-末端的修饰导致不能结合CO2+。Bar-Or等还研究了选择性经皮冠状动脉腔内形成术（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）过程中球囊扩张（>3min）压迫可引起短暂的缺血,从而观察了IMA的动态变化.在PT-CA前,PTCA后立即、6h及24h检测血浆IMA、CK-MB，肌红蛋白（myoglobin，Mb）及肌钙蛋白I（cTnI）水平，发现PTCA后立即采取的标本其IMA显著升高，而CK-MB、Mb和cTnI均未升高，但在PTCA后6h和24h则显著升高，这就提示在PTCA期间，暂时性冠脉闭塞不久IMA即显著增高，且在CK-MB，Mb和cTnI增高之前，进一步证实了早期心肌缺血其白蛋白被修饰。Bhagavan等选择了7例ACB试验吸光度单位（absorbance units，ABSU）增高，且在CK-MB，Mb和cTnI增高之前，进一步证实了早期心肌缺血其白蛋白被修饰。Bhagavan等选择了7例ACB试验吸光度单位（absorbance units，ABSU）增高（≥0.7,诊断有心肌缺血）的血清及1例ABSU低值(0.35)的血清,进行分离纯化白蛋白,然后测其N-末端氨基酸序列,发现所有白蛋白标本在第11个氨基酸残基之前都有正常的N-末端氨基酸序列,除1例缺少N-末端天门冬氨酸-丙氨酸二肽外,而这例并非心肌缺血患者,因此,认为在心肌缺血期引起CO2+结合到白蛋白上发生改变的确切生化机制,目前尚不清楚.
IMA的测定方法
目前,IMA测定方法是采用白蛋白结合钴试验(ACB试验).Bar-Or等首先建立了一种手工分光光度法,方便、简易,适合基层单位使用。
原理：血清中正常白蛋白以活性形式存在，加入氯化钴溶液后，CO2+可与白蛋白N-末端结合，溶液中的游离CO2+浓度较低，而心肌缺血患者血清中含有较多的修饰白蛋白，加入同样浓度的氯化钴溶液后，由于IMA与CO2+结合的能力减弱，使溶液中存在较高浓度的游离钴，加入二巯苏糖醇（1，4-dithiothreitol，DTT），溶液可与游离钴发生颜色反应，以分光光度法测定其吸光度，即可推测IMA含量，以吸光度单位报告结果。
Bar-Or等用手工法检测了99例心肌缺血患者的血清，ACB试验（- χ ±s）为（0.519±0.086）ABSU,40例无缺血证据的患者血清ACB试验为(0.316±0.092)ABSU,参考上限定为0.400ABSU,>0.400ABSU者被认为缺血阳性,<0.400ABSU者为缺血阴性.Bhagauan等用相同的ACB试验方法检测了75例心肌缺血患者为(0.63±0.25)ABSU,范围(0.45~1.00)ABSU,92例非缺血个体为(0.43±0.10)ABSU,范围(0.30~0.60)ABSU,参考上限定为0.50,鉴别心肌缺血和非缺血个体的灵敏度和特异性分别为88%和94%.
Christenson等采用美国Ischemia Technologies公司的IMA度剂盒,用COBAS MIRA或FARA系统(Roche Diagnostics)进行自动分析,该方法需将样本用CoCl2作预处理,取上清液移至仪器样品杯中待测,进行预处理的目的是除去用防腐剂的螯合剂,它可能存在于接静脉同xxxx患者的样品中,在ACB仪器分析中,经处理的样品加氯化钴溶液,保湿5min后,加入DTT试剂,以500nm检测吸光度,用5个含(6~186)U/ml的校准物制备校准曲线,从而本得ACB试验结果.该法测得109例参考人群ACB结果呈正态分布,范围(25.7~84.5)U/ml(平均值58.7U/ml,中位数59.5U/ml),第95%位数上限为80.2U/ml,经受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析,ACB试验的{zj0}临力量值为75U/ml,≥75U/ml被认为心肌缺血阳性,其诊断灵敏度为83%,特异性为69%.
Sinha等用上述同样方法和试剂盒在Roche Cobas MIRA Plus生化仪上进行了208例急性胸痛患者血清的ACB试验,以厂家提供的参考上限85U/ml(111例表现健康人第95%位值),≥85U/ml考虑为心肌缺血阳性,对急性缺血性胸痛诊断灵敏度为82%.
Gidenne等在Cobas MIRA Plus特殊化仪上进行ACB试验并分析研究其性能,其批内和批间CV均<4%;甘洞三酯浓度达7mmol/L,血红蛋白达3.8g/L时无明显干扰,表现明显的肝红素无干扰.血甭和肝素化血浆结果不相等,宜用血清测定;男女间性别和不同年龄间结果无统计学意义.血液标本采取后应在5h内完成分析,标本在室温下充分凝集后离心分离血清,如不能及时分析,应将血清标本贮存于-20℃或更低温度下,分析前将冷冻标本置室温下融化并充分混匀再进行测定.Sinha等认为用这种方法处理的血清标本,其试验结果与新鲜标本无统计学意义.
IMA的临床应用研究
2003年2月,美国食品药品管理局(the Food and Drug Administration,FDA)已批准IMA测定作为早期心肌缺血的生化标志物,用于对低危患者辅助ACS的诊断.从2000~2004年,许多学者在欧洲美国和加拿大进行了大量临床研究[2，3，5~7]，有些学者还研究了各种xx方法和干预措施对IMA的影响。
Bar-Or等检测了胸痛患者和非胸痛患者的血清IMA水平，发现99例胸痛患者中有95例IMA水平增高，而40例非胸痛患者有37例IMA水平正常。Bhagavan等进行双盲研究，将ACB试验结果与{zh1}的出院诊断相比较，75例心肌缺血的急症患者和92例健康个体的结果表明，以0.50ABSU为临界值，IMA对心肌缺血的诊断灵敏度和特异性分别为88%和94%，阳性预期值（positive predictive value，PPV）和阴性预期值（negative predictive value，NPV）分别为92%和91%，受试者工作特征（receiver operating characterictic，ROC）曲线下面积达0.95,表明IMA可有效地将UA,心肌坏死与非心脏疾病,心绞痛样综合征区分开,同时,发现ACB试验区分非AMI缺血与AMI的能力较差,ROC曲线下面积0.66,证明IMA为缺血标志物而不是坏死标志物.
Christenson等在其多中习研究中,以患者变诊1h内采取血液标本测定cTnI、IMA，以及此后的6~24h内多次测定，通过其中224例患者结果绘制ROC曲线来反映IMA对cTnI的预测能力，在ACB试验最适的临界值（75U/ml）时，其灵敏度和特异性分别为83%和69%，PPV和NPV分别为33%和96%，ACB试验具有较高的NPV值和对cTnI阴性或在此后6~24h出现了性的预测灵敏度，对于减少那些低危患者不必要的住院具有重要意义。
Sinha等对205例急性胸痛患者就诊时记录ECG，同时采血测定IMA和cTnT，比较了三者诊断ACS的性对，结果表明，IMA是诊断急性缺血性胸痛的敏感指标（见表1），IMA对ACS的检出灵敏度约为ECG的2倍，cTnT的4倍，由于ECG与cTnT同时观察是胸痛的常规诊断方法，对UA的灵敏度仅为53%，而加入IMA后，其诊断灵敏度可上升至95%，本研究中确诊ACS的患者95%表面为cTnT正常，其中仅32%可依据ECG的改变来诊断，而IMA确诊率达91%，显示了明显的优势，三者联合检测时其ROC曲线下面积增加至0.83，进一步证实了IMA的临床应用价值。
Sinha等还研究实施经皮冠脉介入（percutaneous coronary intervention，PCI）患者和实施诊断性血管造影患者的IMA和8-异前列腺素F2-A（8-isoprostaglandin，iP）水平。应用ACB试验测定IMA和酶免疫分析法检测iP。对PCI患者，在PCI前和气囊充气后从引导管采取血液标本，并在PCI后30min从股鞘采取血标本。PCI时，19例有胸痛的患者中，18例有一过性缺血性ST段改变，检测结果显示，PCI后19例患者有18例的IMA从基线升高，30min时仍保持升高，在12h恢复至基线水平，这些患者的iP水平增加不大，在对照组中，血管造影术前后的IMA和iP水平均无明显的改变，这些结果表明，在PCI时发生胸痛和ST段改变的患者中，IMA是一个比iP诊断缺血更为一致的标志物，IMA是PCI诱导缺血的一种灵敏的标志，在临床上具有重要作用。
Roy等对疑似ACS患者检测了IMA和cTnT水平，这些患者ECG正常或无诊断意义，在胸痛后3h内检测IMA和cTnT，根据医院诊断结果将患者分为ACS和非缺血性胸痛（non-ischemic chest pain，NICP）两组。结果显示，ACS患者平均IMA水平高于NICP患者（P<0.0001）.以试剂盒厂家临界值(85U/ml)为标准,其IMA对ACS的诊断灵敏度和特异性为90.6%和49.3%,NPV为84.6%.结合6~12h cTnT(>0.05ng/ml),其灵敏度为92.2%.经多变量分析表明,以IMA水平>85U/ml,其优势比(odds ratio,OR)=14.6(P<0.0001).Roy等认为,在典型急性胸痛而ECG正常或无诊断意义时,IMA是鉴别ACS有用的生化指标.
Pollack等综述了8项研究结果表明,IMA具有较高的阴性预测值,当与cTnT(或cTnI)和ECG联合使用时,在高危患者群NPV为84%,而在低危患者群则达91%~{bfb},联合应用IMA,cTnT(或cTnI)和ECG进行危险分层的策略,可帮助医师处理急性胸痛患者,当cTnT(或cTnI)增高或ECG显示ST段改变的患者,即可诊断ACS,患者需要及时住院xx,当有典型胸痛症状而cTnT(或cTnI)及ECG均无诊断性改变的患者,如IMA正常,则患者近期发生心肌缺血事件的危险性小,可允许患者出院.如果医生根据临床表现判断ACS可能性大,则需密切观察病情变化,如出现IMA增高提示患者发生心肌缺血的危险性大,应当尽早积极xx,有了IMA结果用于危险性大,应当尽早积极xx,有了IMA结果用于危险分层,可指导医师尽早制定患者的处理方案,不必等到6H后根据cTnT(或cTnI)结果不确定.
IMA临床使用时应注意的问题
从目前研究结果可看出,IMA的特异性不及ECG或cTnT,因此不能盲目地以IMA增高诊断ACS,而应结合临床状况综合分析.IMA的特异性不高可能与以下因素有关:白蛋白随血液循环到体内各组织器官,在非心源性缺血时可出现IMA水平升高,如脑缺血(卒中),肾脏终末疾病,肝硬化,某些严重传染病以前某些进行性肿瘤患者组中IMA均可升高,IMA作为氧化应激的标志物可用来检出任何缺血事件,为临床医师对患者进行详细检查提供依据.有研究证明,缺氧、自身免疫性疾病，骨骼肌缺血，良性胃肠疾病，创伤，非心肌缺血，使用兴奋剂以及外伤时，IMA均无明显升高。Apple等研究发现，耐力训练（如马拉松跑）后即该测定IMA无明显变化，说明骨骼肌缺血不会对IMA水平产生影响，但24~48h后，由于胃肠道缺血IMA水平显著升高，剧烈运动或其他病理情况可引起体液转移和白蛋白浓度变化，从而对IMA水平产生影响。Roy等对23例（男15例，女8例，平均年龄67岁）典型跛腿并有周围血管疾病（peripheral vascular disease，PVD）的患者进行踏车运动应激试验以诱导腿部缺血，在运动后即该和运动后1h采血测定IMA，发现骨骼肌诱导缺因后即该IMA显著低于运动前基线值，以运动后1H恢复基线水平，且与患者疾病严重度有关，因此本综述认为IMA浓度可受骨骼肌缺血影响，对PVD患者检测IMA应考虑这一因素，IMA假阳性还可见于遗传缺陷导致白蛋白N-末端氨基酸缺失的患者，人群中这种缺失的发生频率尚不清楚，使得IMA阳性结果的解释复杂化，一些学者还研究了各种xx、干预措施对IMA水平的影响，如气囊血管成形术，射频导管消融术和PCI等，结果表明IMA对一过性缺血反应迅速、并在数小时骨恢复正常。因此，临床医师在IMA结果解释时应考虑上述情况。
摘自：《国际检验医学杂志》2006年1月第27卷第1期
表1 3种心肌缺血检查方法对ASC的诊断性能
心肌标志物 灵敏度% 特异性% PPV% NPV% ROC曲线下面积
IMA 82 46 72 59 0．68
ECG 45 91 89 49 0．68
CTnT 20 99 96 42 0．64
ECG+cTnT 53 90 90 53 0．74
IMA+cTnT 90 44 73 72 0．77
IMA+ECG 92 43 73 77 0．80
IMA+ECG+cTnT 95 42 74 84 0．83
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