本文主要叙述一下蛋白质、酶和核酸分离纯化中与溶解度有关的一些方法。
1．蛋白质分离纯化的一些方法
（1）盐析法
①原理：

        盐析法对于许多非电解质的分离纯化都是适合的，也是蛋白质和酶提纯工作应用最早，至今仍广泛使用的方法。其原理是蛋白质、酶在低盐浓度下的溶解质随着盐液浓度升高而增加（此时称为盐溶）；当盐浓度不断上升时，蛋白质和酶的溶解度又以不同程度下降并先后析出，称为蛋白质的盐析。这一现象是由于蛋白质分子内及分子间电荷的极性基团有着静电引力，当水中加入少量盐类时，由于盐类离子与水分子对蛋白质分子上的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大。但盐浓度增加到一定程度时，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜被破坏，于是蛋白质就相互聚集而沉淀析出。盐析法就根据不同蛋白质和酶在一定浓度的盐溶液中溶解度降低程度的不同而达到彼此分离的方法。
②盐的选择：

        蛋白质盐析常用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最广的是硫酸铵，其优点是温度系数小而溶解度大（25℃时饱和溶解度为4.1mol/L，即767g/L；0℃时饱和溶解度为3.9mol/L，即676g/L），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来，而且硫酸铵价廉易得，分段效果比其他盐好，不容易引起蛋白质变性。应用硫酸铵时，对蛋白氮的测定有干扰，缓冲能力比较差，故有时也应用硫酸钠，如盐析免疫球蛋白，用硫酸钠的效果也不错，硫酸钠的缺点是30℃以上溶解度太低。其他的中性盐如磷酸钠的盐析作用比硫酸铵好，但也由于溶解度太低，受温度影响大，故应用不广。
　　硫酸铵浓溶液的pH在4.5~5.5之间，市售的硫酸铵常含有少量游离硫酸，pH值往往降至4.5以下，当用其他pH值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节　。

③硫酸铵饱和度计算法及加入方式：

        在分段盐析时，加盐浓度一般以饱和度表示，饱和溶液的饱和度定为{bfb}。用硫酸铵盐析时其溶液饱和度调整方法有3种。一是当蛋白质溶液体积不大，所需调整的浓度不高时，可加入饱和硫酸铵溶液；饱和硫酸铵配制方法可加入过量的硫酸铵，热至50~60℃保温数分钟，趁热滤去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1~2天，有固体析出时即达{bfb}饱和度。盐析所需饱和度可按下式计算：

　　式中V及V₀分别代表所需饱和度硫酸铵溶液及原溶液的体积，S₂及S₁分别代表所需达到的和原溶液的饱和度。严格来说，混合不同体积的溶液时，总体积会发生变化使上式造成误差，但这由体积改变所造成的误差一般小于2%。故可忽略不计。另一种是所需达到饱和度较高而溶液的体积又不再过分增大时，可直接加入固体硫酸铵，其加入量可按下式计算：

　　式中X是将1升饱和度为S₁的溶液提高到饱和度为S₂时所需硫酸铵的重量（g），G及A为常数，与温度有关。G在0℃时为707，20℃时为0.29。为方便起见，在室温及℃时所需硫酸铵的饱和度可直接查表2-1、表2-2求出。　

        盐的饱和度是影响蛋白质盐析的重要因素，不同蛋白质的盐析要求盐的饱和度不同。分离几个混合组分的蛋白质时，盐的饱和度常由稀到浓渐次增加，每出现一种蛋白质沉淀进行离心或过滤分离后，再继续增加盐的饱和度，使第二种蛋白质沉淀。例如用硫酸铵盐析分离血浆中的蛋白质，饱和度达20%时，纤维蛋白原首先析出；饱和度增至28%~33%时，优球蛋白析出；饱和度再增至33%~50%时，拟球蛋白析出；饱和度大于50%以上时，白蛋白析出。用硫酸铵不同饱和度分段盐析法，从牛胰中酸性提取分离可得到九种以上蛋白质及酶。
2）pH值：

        在等电点时，蛋白质溶解度最小容易沉淀析出，因此，盐析时除个别情况外，pH值常选择在被分离的蛋白质等电点附近。
3）蛋白质浓度：      

        在相同盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度的极限愈低，如血清球蛋白的溶度从0.5%增到3.0%时，需用中性盐的饱和度的{zd1}极限从29%递减至24%。某一蛋白质欲进行两次盐析时，第1次由于浓度较稀，盐析分段范围较宽，第2次则逐渐收窄，例如用硫酸铵盐析胆碱酯酶时，第1次硫酸铵饱和度为35%至60%，第2次为40%至60%。蛋白质浓度高些虽然对沉淀有利，但浓度过高也容易引起其他杂蛋白的共沉作用，因此，必须选择适当浓度，尽可能避免共沉作用的干扰。
4）温度：

        由于浓盐液对蛋白质有一定保护作用，盐析操作一般可在室温下进行，至于某些对热特别敏感的酶，则宜维持低温条件。虽然蛋白质在盐析时对温度要求不太严格，但在中性盐下结晶纯化时，温度影响则比较明显。
5）脱盐：

        蛋白质、酶用盐析法沉淀分离后，常需脱盐才能获得纯品。最常用的脱盐方法是透析法，如图2-1所示：把蛋白质溶液装入透析袋中，袋的二端用线扎紧，然后用蒸馏水或缓冲液进行透析，这时盐离子通过透析袋扩散到水或缓冲液中，蛋白质分子量大不能穿透析袋而保留在袋内，通过不断更换蒸馏水或缓冲液，直至袋内盐分透析完毕。透析需要较长时间，常在低温下进行，并加入防腐剂避免蛋白质和酶的变性或微生物的污染。此外用葡聚糖凝胶脱盐的效果也很好。

                         图2-1　透析装置图
（2）有机溶剂沉淀法：

        有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导致溶解度的降低；另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法，称“有机溶剂分段沉淀法”，它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。由此法析出的沉淀一般比盐析容易过滤或离心沉降，分离后的蛋白质沉淀，应立即用水或缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。操作时的pH值大多数控制在待沉淀蛋白质的等电点附近，有机溶剂在中性盐存在时能增加蛋白质的溶解度，减少变性，提高分离的效果，在有机溶剂中添加中性盐的浓度为0.05mol/L左右，中性盐过多不仅耗费有机溶剂，可能导致沉淀不好。沉淀的条件一经确定，就必须严格控制，才能得到可重复的结果。有机溶剂浓度通常以有机溶剂和水容积比或用百分浓度表示。有机溶剂沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂易除去；缺点是易使酶和具有活性的蛋白质变性。故操作时要求条件比盐析严格。对于某些敏感的酶和蛋白质，使用有机溶剂沉淀尤其要小心。
（3）等电点沉淀法：

        利用蛋白质在等电点时溶解度{zd1}而各种蛋白质又具有不同等电点的特别进行分离的方法，称为等电点沉淀法。但在等电点时，各种蛋白质仍有一定的溶解度而使沉淀不xx，同时许多蛋白质的等电点十分接近，故单独使用此法效果不理想，分辨力也差。大多用于提取后去除杂蛋白，即利用变动提取液的pH值使某些与待提纯的蛋白质等电点相距较大的杂蛋白从溶液中沉淀出。实际工作中常把等电点沉淀和盐析法、有机溶剂沉淀法联合使用。
（4）吸附法：

        在蛋白质的提纯方法中，选择性吸附也是应用历史较久迄今仍在广泛采用的方法之一。早期工作常用高岭土 （我国的一种土质，其分子式大致是AL₂O₃·2SiO₂·2H₂O）、氧化铝（AL₂O₃）及活性炭等吸附剂，由于这些吸附剂吸附力较弱，或者易引起蛋白质变性而应用不广，现已为凝胶性吸附剂所代替，如氢氧化铝凝胶和磷酸钙凝胶，尤其后者使用最广。

        吸附剂的应用有两种不同方式。当蛋白质较易吸附时，可以选择适当条件主要吸附蛋白质而分离去杂质；当蛋白质较难吸附时，则选择利于吸附杂质条件将杂质与蛋白质分开。有时两种方法可先后使用，以达到较高的提纯目的。吸附条件通常在微酸性条件（pH5~6）及稀盐溶液中进行，盐浓度过高会干扰对蛋白质及酶的吸附，亦即是说需要用更多量的吸附剂才能达到一定结果。洗脱时一般在弱碱条件下或适当提高洗脱液离子强度，可将吸附的蛋白质或酶xx洗脱下来。
　　吸附操作可以用静态吸附，也可以用柱层析吸附，即将凝胶装成柱进行吸附操作。凝胶装柱后如溶液的通过能力很差，可用助滤剂（如硅藻土）和凝胶混合，当调整二者的比例时得到一系列通过能力和吸附能力不同的层析柱。最近还使羟基磷灰石[Ca₁₀(PO₄)₆．（OH）₂]分离蛋白质和酶，它可以在高盐浓度下吸附中性及酸性蛋白质而排除碱性蛋白质。吸附常在pH6.8的磷酸缓冲液中进行。洗脱xx时凝胶可反复使用3~4次，吸附杂质较多的凝胶以0.1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸洗净后再用。
（5）离子交换法：

        蛋白质和酶都具有电解质性质，故可用离子交换剂进行分离提纯，特别是经过了初步纯化后的蛋白质和酶采用此法效果尤为显著。主要介绍一下近年来以纤维素衍生物作为离子交换剂纯化蛋白质及酶的方法。在这类衍生物中以二乙氨基乙基纤维素（简称DEAE-纤维素，为阴离子交换剂）及甲基纤维素（简称CM-纤维素，为阳离子交换剂）应用最广泛。
DEAE-纤维素是纤维素结构中的氢原子被一定量的二乙氨基-乙基取代而成弱碱性化合物，它作为阴离子交换剂的原理是：

             
　　在实际工作中常用磷酸缓冲液平衡DEAE-纤维素后，才对蛋白质进行交换吸附的，故上式B^-可视为PO₃^-。用DEAE-纤维素吸附酶和蛋白质时常用pH为7~9，然后提高盐浓度（使蛋白质与交换剂的结合键减弱）或降低pH使之洗脱，洗脱后的蛋白质溶液有时可进一步上CM-纤维素柱纯化。作为阳离子交换剂，CM-纤维素吸附蛋白质的原理如下：   

               
 　　式中A⁺可为H⁺或Na⁺，视平衡CM-纤维素时所用溶剂而定。CM-纤维素常选在pH4.5~6.0左右吸附蛋白质，然后提高pH或盐浓度进行洗脱。离子交换纤维素对大分子物质有较大交换量，例如CM-纤维素对血红蛋白的交换量为93~98mg/100mgCM-纤维素。此外，纤维素离子交换剂还具有层析条件温和、物质易于洗脱、分辨力强、被分离的蛋白质不易变性等优点。
　　除了纤维素离子交换剂外，离子交换凝胶也是目前应用于分离蛋白质和酶的一种很好的离子交换剂。常用的有DEAE-葡聚糖凝胶和CM-葡聚糖凝胶。离子交换凝胶不仅具有交换当量高、层析条件温和、操作简便等优点，而且兼具分子筛的性能，在梯度洗脱时，对不同分子量的蛋白质具有很高的分辨能力。