聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因

内 容 提 要

利用PCR技术扩增目的基因是一个设计性实验。首先对数据库进行基因检索，并以此为模板，利用分子生物学软件设计引物；然后使用PCR仪进行基因扩增，并对产物进行电泳检测，凝胶成像系统分析实验结果。此外，还可以用纳米材料来优化反应条件，提高基因扩增效率。  

本实验要求：

1、能够使用 Primer Premier 5.0 等分子生物学软件设计和分析引物。

2、初步学习利用NCBI（美国国立生物技术信息中心）等生物信息学数据库。

3、掌握PCR的原理和技术，并能够对PCR反应进行优化。

原      理

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是一种体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，亦称为体外酶促基因扩增。PCR与分子克隆和核酸序列分析方法几乎构成了整个现代分子生物学的实验工作的基础。近年来伴随着PCR技术的发展，PCR不但可以对目的基因进行定性，而且可以定量（即原始模版的确切数目），因此广泛应用于遗传学、微生物学、医学乃至整个生命科学的研究中。

PCR的原理类似于DNA的xx复制过程。利用耐热的DNA聚合酶，在待扩增的基因片段两侧和与其互补的两个引物，经过变性、退火和延伸等三步的一个循环，实现模板DNA拷贝数增加一倍，在以后进行的循环过程中，每一循环的产物作为下一轮循环的模板。n次循环后，拷贝数增加2ⁿ倍 (图1)。因此，进行25-30个循环后，拷贝数即可达到上百万倍(10⁶)。

PCR的基本反应体系包括：需要扩增的模板（template）、一对寡核苷酸引物（primers）、4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）、耐热DNA聚合酶（DNA polymerase）缓冲液（reaction buffer system）、二价阳离子（Mg²⁺）等。纳米材料做为新型的PCR增效剂不仅可以增加PCR特异性和效率，而且可以提高PCR反应的灵敏度。这是迄今为止其它类型的PCR所无法比拟的。实验中用纳米金（10nm）作为PCR的增效剂来提高扩增效率，使扩增的特异性增强，有利于下一步的基因操作。

本实验由每组学生分别查找枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的相关基因，在教师的指导下设计引物，利用上次实验提取的基因组DNA作为模板，独立进行PCR、电泳检测和凝胶成像等操作，并利用学过的知识对PCR反应条件进行优化，提高扩增的效率。

图1. PCR 反应原理图

一、主要仪器、 材料、和试剂

1．仪器

基因扩增仪（PCR仪），水平式电泳装置，电泳仪，台式高速离心机，微量移液器，紫外透射仪，凝胶成像系统。

2．材料

基因扩增的模板为实验3提取的xx基因组DNA。

3．试剂

Taq DNA聚合酶，引物，10×PCR Buffer（含Mg²⁺），DNA Marker和琼脂糖(Agarose)等购自上海生工公司。

二、操作步骤

1. 在NCBI的数据库中查找相关的基因序列，利用Primer Premier 5.0 等分子生物学软件设计和分析引物。每个实验组分别设计两个引物，引物序列设计好以后就可以直接委托相关的生物技术公司合成，合成好的引物寡核苷酸配置成20μM贮存液。

引物设计使用Primer Premier5软件，并遵循以下原则：

⑴ 引物的长度一般在18bp~28bp之间，对于长片段扩增来说，引物的长度在这个范围内适当取长；

⑵ 引物的GC含量一般为40％~60％，不能过高或过低，上下游引物的GC含量应不要相差太大，另外两对引物的Tm值应尽量接近，一般应相差不超过3℃，这有利于引物的特异性退火；

⑶ 在其它条件都符合的条件下，尽量选择引物在模板上错配位点少的引物对，另外，引物3’端应尽量避免出现三个以上的重复碱基和A碱基。这样可以防止错配引起的非特异性产物；

⑷ 引物二聚体及发夹结构能引起引物的有效浓度降低，从而导致扩增失败。因此应尽可能避免引物二聚体及发夹结构。

2. 在0.2ml的PCR管内配制25μl反应体系：

反应物                                                     体积/μl

10× PCR buffer                                        2.5

dNTP   (2.5mM)                                    2.0

引物1  (2μM)                                        2.5     

引物2  (2μM)                                        2.5     

Taq酶  (5U/μL)                                     0.5

Template                                                   1

ddH₂O                                                      13

总体积                           25

3．将PCR反应体系混匀，按以下循环条件在基因扩增仪上进行PCR循环：

预变性　　92℃          3min

变性　　　92℃          30s

退火　　　61℃          40s    32循环

延伸　　　72℃          50s

xx延伸　72℃          10min

4. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果

配制0.8%琼脂糖凝胶，取5μL扩增产物电泳。保持电流40mA。电泳结束后，利用凝胶成像系统分析扩增效果。

5.  PCR反应条件的优化

⑴. 增效试剂的应用：根据PCR扩增的效果，如果出现非特异性扩增，影响下一步基因操作，选择纳米金（10nm）1μl加入到反应体系中，PCR结束后检测扩增的效果是否有所改进。

⑵. 反应程序的优化：采用降落PCR（Touchdown PCR）的方法提高基因扩增的特异性。降落 PCR通过在PCR的前几个循环使用严紧的退火条件提高特异性。最初的循环在高于Tm值大约5℃的退火温度下开始，然后每个循环降低1℃到2℃，直到退火温度低于Tm 5℃。{zh1}进行电泳检测，比较基因扩增效果。

三、思考题

1. 退火温度Tm是如何计算得到？

2. PCR循环次数是否越多越好？为什么？

3. 如果电泳出现了弥散现象，可能有哪些原因？

4. 如何确保你设计引物的特异性？