《您会成为制作纳豆的高手》
2010-02-28 13:56:37 阅读5 评论0 字号：大中小
血栓疾病是一类严重危害人类健康和生命的疾病，包括心血栓、脑血栓、肺栓塞和末梢动静脉血栓等常见疾病。据估计，全世界有血栓性疾病患者约1500万人，其中每年死于心脑血栓疾病的就高达1200万人。在我国，血栓性疾病造成的损失也极为严重，尤其是随着人们生活水平和生活方式改变导致膳食中高脂肪、高蛋白的过量摄取和老龄化社会的到来，血栓性疾病已超过癌症和糖尿病成为{dy}健康杀手，每年约有100万人因此死亡。
目前临床上xx血栓和栓塞主要是通过注射尿激酶（UK）、链激酶（SK）、组织型纤溶酶原xx剂（t-PA）、乙酰化纤溶酶原链激酶xx剂（APSAC）和单链尿激酶型纤溶酶原xx剂（SCUPA）。些xx均为纤溶酶原xx剂，通过xx纤溶酶原生成纤溶酶而降解纤维蛋白。在实际应用中它们都具有一定的局限性，或是毒性比较强，易引起出血，不良反应大；或是在体内半衰期短,且不易被吸收,只能静脉给药,药效难以发挥；或是来源紧缺,成本高,价格昂贵。
1987年，日本学者须见洋行等首次报道在纳豆中存在一种具有强烈纤溶活性的酶—纳豆激酶。20年来,研究者们对纳豆激酶的理化特性、作用机制及生产工艺等方面进行了较为详尽的研究。实验研究证实,该酶不仅易于提取纯化，成本低廉，溶栓效果好，作用迅速，药效时间长，而且安全性好，无任何毒副作用。因此，有望成为一种新型溶栓xx。
回复网友制作纳豆的一些问题
有不少网友在在制作纳豆时关于无菌操作问题,我告之一个小窍门:在煮沸水的水蒸气上方就是无菌区域（用口径大的水煲煮）,您可在上面操作,我曾搞过食用菌的繁殖及芦荟组织培养,肓种就是用这个土办法的,百试百灵。
也有不少网友提到如何在寒冬制作纳豆时的保温保湿问题,我也告之一个行之有效的土办法:为了保证酸奶机内温度的恒定,保持酸奶机内湿度的足够,就得提高酸奶机外的温度和湿度。有一个简易的做法,就是用两个大小不同的纸皮箱,小的纸皮箱能放置酸奶机及加湿热即可, 大小纸箱之间填充泡沫作保温层,在小箱内的上方挂两只串联的20或40瓦(瓦数要相同)的灯泡(一定要串联,才会产生红外线而生热量)供箱体产热之用,我过去曾用此法繁殖家禽呢,很好用。干燥季节记得开加湿机加湿。
有不少热衷于制作纳豆的网友,在实践中都或多或少会有点新的想法:纳豆菌种有点贵(50-100元/瓶，只能制作纳豆三十次), 为了减少成本,有什么办法在原有的菌种能多做些纳豆吗？如何提高纳豆里纳豆激酶的含量？有什么办法改善纳豆的口感？还可制作其他纳豆产品吗？还有……。
本文收集了不少有关制作纳豆的资料,内容丰富,值得一看.当您利用了这些资料制作纳豆时,上面种种急待解决的难题便会迎刃而解了.您会感到如虎添翼,得心应手.您将会成为制作纳豆的高手。
如人们每天都能以纳豆为食，长寿将与您共存！
纳豆菌的培育
提供一种简捷、有效的纳豆菌培育繁殖方法。
上述目的是这样实现的：
用水浸泡大豆，大豆膨胀到2倍左右时，蒸或煮熟，按与浸泡前大豆重量4000—10000：l的比例取纳豆菌菌种放进容器，加入菌种量1000-1500倍的60-100℃温开水或开水稀释菌种；将植入菌种的熟大豆进行发酵，发酵温度37—40℃，发酵时间20—24小时，纳豆菌便得到培育繁殖。
也可用纳豆培育纳豆菌：用水浸泡大豆，大豆膨胀到2倍左右时，蒸或煮熟，按与浸泡前大豆重量40：1的比例将纳豆直接加入熟大豆中，拌匀均匀，进行发酵，发酵温度37-40℃，发酵时间20-24小时，纳豆菌便得到培育繁殖。
以纳豆菌为菌种、用熟大豆作培养基，通过接种、发酵达到培育繁殖纳豆菌的目的。其特点是：材料易取、设备简单、方法有效。
具体实施方式
1、挑选大豆。去掉大豆中的杂质以及虫蠹、发霉的豆粒。
2、清洗大豆。将大豆置于清洗容器中，加上足够净水清洗大豆，洗净后捞出大豆倒入浸泡容器中。
3、浸泡大豆。在浸泡容器中加入2.5-3倍于大豆的净水，盖上容器，以防进入异物。浸泡10—16小时，待大豆膨胀到2倍左右时，捞出大豆空掉水分。
4、蒸煮大豆。在使用压力锅的情况下，将浸泡好的大豆蒸50—70分钟(视锅内压力而定)。如不使用压力锅，蒸煮时间为l80-240分钟。大豆熟透标准：用手指轻轻一捏就破即可。
5、器具xx。将容器、勺子、筷子及橡胶手套用开水冲煮、除去杂菌。
6、调配菌液。戴上灭过菌的橡胶手套，按与浸泡前大豆重量4000—10000：1的比例(大豆4000-10000份、纳豆菌1份)取菌种放进容器，加入纳豆菌1000—1500倍量的60一100℃温开水或开水，用勺子搅拌稀释菌种。
如果没有现成纳豆菌，可用新鲜纳豆替代。在使用新鲜纳豆的情况下，不必用水稀释。将熟透大豆控掉水分、倒进消过毒的容器中。容器中熟大豆的厚度以2～3厘米为益。按40：l的比例(40份熟大豆、1份新鲜纳豆)将纳豆直接搀入熟大豆中，用消过毒的筷子轻轻将菌种、熟大豆搅拌均匀。
7、恒温发酵。将植入菌种的熟大豆放进发酵箱、发酵罐或发酵室(窖)。温度以控制在37-40℃为宜，发酵时间可掌握在20-24小时。也可将植入菌种的熟大豆放在30-37℃的环境中发酵，发酵时间24-48小时。
通过上述工序，纳豆菌便得到了培育繁殖。
根据需要，可以把发酵好的大豆分别进行如下处理：
(1)用3-5倍的凉开水把发酵好的大豆稀释成纳豆液、滤去其中大豆，将纳豆菌液装进无菌容器冷冻保存。
(2)利用离心方式或板框过滤、喷雾干燥方式将稀释的纳豆液提纯成纳
纳豆的制作
提供一种工艺简单、操作方便的纳豆食品的制作方法。
大豆食品的制作方法，包括下述步骤：
①将大豆清洗后，将其破碎成粒度为3-6mm的颗粒；
②将上述大豆颗粒用3倍量的水进行浸泡，浸泡时间为8～36小时；
③将浸泡好的大豆放进锅内蒸1.5~2.5小时，或用普通高压锅煮10-20分钟；
④将蒸煮熟的大豆装入无菌罐内，同时喷洒发酵剂5～10ml／kg，所述发酵剂为含有0.05～0.15％的盐、0.15～0.3％发酵大豆和2-3％的无菌水；
⑤将上述接种后的大豆均匀平铺于无菌容器中，厚度为2～3cm，再喷洒发酵剂7-15ml／kg，然后密闭；
⑥将上述密闭容器置于37-42度条件下培养20～24小时，发酵完成得到纳豆。
所述纳豆在O℃冷藏保存或进行分装冷藏保藏。所述制作过程空气的相对湿度为25～55％。
实施例1：
将大豆l000g进行彻底清洗，将洗净的大豆破碎，破碎成粒度为3～6mm的颗粒(一般一粒大豆被破为6瓣左右)，然后用3000g的水进行浸泡，夏季浸泡时间为8～12小时，以使大豆吸水重量增加2~2.5倍为{zh0}：将浸泡好的大豆放进锅内蒸2.0小时：将蒸煮熟的大豆装入无菌罐内，同时喷洒发酵剂，发酵剂为含有15mg的盐、20mg糖、发酵大豆300mg的无菌水；将上述接种后的大豆均匀平铺于无菌容器中，厚度为2～3cm，再次喷洒发酵剂，然后密闭；将上述密闭容器置于37～42度条件下培养20～24小时，发酵完成得到纳豆。
纳豆在O℃冷藏保存或进行分装冷藏保藏。
生产过程中接触原料的所有器具均要进行xx、xx，以避免杂菌的混入，并且生产过程中环境相对湿度一般控制在25-55％。
实施例2：
将大豆5000g进行彻底清洗，将洗净的大豆破碎，破碎成粒度为3-6mm的颗粒(一般一粒大豆被破为6瓣左右)，然后用l5000g的水进行浸泡，浸泡时间为20-24小时，以使大豆吸水重量增加2～2.5倍为{zh0}；将浸泡好的大豆放进普通高压锅，在充分放气后煮l5～20分钟；将蒸煮熟的大豆装入无菌罐内，同时喷洒发酵剂，发酵剂为含有50mg的盐、lOOmg糖、l000mg发酵大豆的无菌水；将上述接种后的大豆均匀平铺于无菌容器中，厚度为2～3cm，再次喷洒发酵剂，然后密闭；将上述密闭容器置于37~42℃条件下培养20-24小时，发酵完成得到纳豆。
生产过程中接触原料的所有器具均要进行xx、xx，以避免杂菌的混入，并且生产过程中环境相对湿度一般控制在25～55％。
实施例3：
将大豆l0000g进行彻底清洗，将洗净的大豆破碎，破碎成粒度为3～6mm的颗粒(一般一粒大豆被破为6瓣左右)，然后用30000g的水进行浸泡，夏季浸泡时间为8～12小时，以使大豆吸水重量增加2～2.5倍为{zh0}；将浸泡好的大豆放进锅内蒸2.5小时；将蒸煮熟的大豆装入无菌罐内，同时喷洒发酵剂，发酵剂为含有200mg的盐、250mg的糖、2500mg的发酵大豆的无菌水；将上述接种后的大豆均匀平铺于无菌容器中，厚度为2—3cm，再次喷洒发酵剂，然后密闭；将上述密闭容器置于37-42℃条件下培养20-24小时，发酵完成得到纳豆。
实施例4：
纳豆激酶制备
目前，采用固体或液体发酵培养微生物，使其产生纳豆激酶，然后再从发酵产物中以常规提取纯化的方法制备纳豆激酶。各种制备方法的差异主要集中在使用的纳豆原材料方面，现分别介绍如下
实例 238
纳豆激酶分布于发酵液中，过滤除去菌体，以硫酸铁盐析获得粗品酶，再以离子交换树脂、分子筛进行纯化，{zh1}进行真空干燥，获得纯化纳豆激酶。
( l ）工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 种子培养基
称取2. 0 份麦芽糖、2.0 份果糖、1.5 份大豆胨、0.2 份酵母浸膏、0.1 份KH2PO4 、0. 3 份K2HPO4 、0.05 份MgSO4? 5H2O 、0.02 份CaC12 ? 2H2O ，然后用去离子水补充至100份。配制成pH 值为7.0的种子培养基
将制备好的种子培养基进行高压xx，xx温度为121 ℃ ，时间为20- 30min 。xx后待培养基冷却至30 ℃ 时，在无菌条件下接种培养基体积2 ％的菌抱子悬液，混合均匀后置于旋转式摇床上，在振幅为25mm 、转速为27Or / min 、30 ℃ 振荡培养18h ，获得一级种子。
② 发酵培养基
称取2.0份麦芽糖、2.0 份果糖、30.0 份大豆浆、0.2 份酵母浸膏、0.1份KH2PO4、0 .3 份K2HPO4、0.05 份MgS04.5H2O 、0.02 份CaCI2? 2H2 O ，用去离子水补充至100份，获得发酵培养基，其pH 值为7.0
③ 发酵
在容积为8L 的LF2G5A 型自控发酵罐中加入5L 发酵培养基，进行自动定温xx。灭均温度及时间同种子培养基高压xx。然后在无菌条件下顺序将种子培养液和经高压xx的甘油聚醚消泡剂加入，种子培养液用量为发酵培养基体积的2 % ，消泡剂用量则为0.1 % （体积分数）。控制发酵温度为（30 士0.2 ）℃ ，pH 值为7.0 ，搅拌转速为8O0r / m 动，通入无油三级过滤空气，通气量为1 倍发酵液体积／min ，发酵时间为76h 。
④ 除杂蛋白
发酵完成后放罐，将发酵液进行离心分离，离心机速度为5000r / min ，时间为20min 。收集上层清液，置于盐析罐中，控制上清液温度低于10 ℃ ，在搅拌下加入硫酸铁，直至饱和度达到25 ％时停止搅拌，静置直至杂蛋白沉淀析出。5000r / min 离心20min ，除去杂蛋白沉淀。
⑤ 盐析、超滤
收集离心上层清液，再次控制其温度低于10 ℃ ，在搅拌下加入硫酸按，直至饱和度达到60％时停止搅拌，然后在同温度下静置过夜。次日虹吸弃上清液，下层浊液进行离心分离，离心机速度为5000r / min ，离心时间20min 。收集沉淀，用少量去离子水溶解后进行超滤除盐，获得豆豉纤溶酶粗品。测定其酶活力，备用。
⑥ 纯化
根据Sephadex G2100 的容量及豆豉纤溶酶粗品的酶活力计算出所需树脂量，称取定量树脂，用去离子水进行溶胀处理。将溶胀2 天的Sephadex G2100 装入色谱柱，用0.lmol / L 磷酸缓冲液（PBS）-0.2mol /L NaCI( pH7.4）缓冲液进行平衡。然后，将粗酶液小心加入柱中，以相同缓冲液进行脱洗，用分部收集器收集有纤溶活性的组分，即为精制豆豉纤溶酶。
此外，还可以用CM -SepharoseFF 离子交换色谱、Superdex75 凝胶色谱等进行精制。用SePhacryls2200 柱色谱纯化豆豉纤溶酶的主要步骤为：将Sephacryls2200 树脂装柱，用0 . lmol / L PBS、0.5mol/ LNaCI 缓冲液（pH 值7 . 4 ）进行平衡，然后上样，并以相同缓冲液洗脱。分部收集呈单一对称峰的活性组分，用蒸馏水透析过夜及冷冻干燥，获得白色粉末豆豉纤溶酶。
( 3 ）主要指标经Sephadex G2100 色谱纯化的豆豉纤溶酶：纯化28 倍，收得率为51 % ；经Sephacryls2200 色谱纯化的豆豉纤溶酶：纯化44 倍，收得率为68 ％。获得的豆豉纤溶酶平均分子量为31000 , PI 为8.6 士0.2 ，豆豉纤溶酶在40 ℃ 以下稳定性良好，50 ℃ 放置lh 则严重失活，60 ℃ 活性全部丧失。该酶在pH 值为7 - 11 稳定，而在pH 值低于5 时很快失活。
生产纳豆激酶
一种利用枯草芽孢杆菌培养产生上述纳豆激酶的方法，其特征是：
利用大豆蛋白胨等氮源、多糖类物质和无机盐进行发酵，发酵温度为36.5—37.5℃，发酵周期l6-50小时，pH 6.5-7.5。经过离心、超滤后，将上清液中加入冷乙醇使其含量达70-80％，或者加固体硫酸铵使饱和度达60-70％，低温沉淀后离心，干燥粉碎，得到纳豆激酶的粗干粉，经凝胶层析后得到纯化产品。
上述的利用枯草芽孢杆菌培养产生上述纳豆激酶的方法，所述的氮源、多糖类物质和无机盐可以选择：
a．固体发酵：采用大豆作为发酵基质。
b．液体发酵：多糖类物质采用麦芽糖、木糖、蔗糖，使用量为：l-8％(重
c所述的无机盐：KH2P04
上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位加入到淀粉或者糊精中，其加入量为每200毫克装量中含5000-10000U纳豆激酶，制成肠溶胶囊，用于xx心脑血管疾病药品.
一种上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位加入到丹参粉、地龙粉中，其重量配比为：纳豆激酶l00-150万酶单位，丹参粉50克，地龙粉30克，制成肠溶胶囊或者口服液，用于xx心脑血管疾病药品。
一种上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将纳豆激酶的纯化产品经冷冻干燥制成医用注射针剂。
这个技术方案有以下有益效果：
1．纳豆激酶是使用枯草芽孢杆菌高产菌株进行发酵生产的高活性的纳豆激酶，是一种具有较高溶纤性能的蛋白激酶，针对纤维蛋白的降解有特异性的显著效果，经临床检验，该产品具有明显溶解人体血管内血栓的的活性，
可以用于多种心脑血管疾病的xx。
2．产品克服了该类产品只能静脉给药的方式，可以制成口服产品，可以通过肠道吸收进入循环系统，用于血栓xx，其释放时间长，并可以促进血管内皮细胞产生组织型纤溶酶原xx因子，xx生物体自身的纤溶酶系统，提高血液的纤溶性能。
3．纳豆激酶是使用枯草芽孢杆菌高产菌株进行发酵生产的高活性的
纳豆激酶，液体发酵的{zg}酶活性达每毫克200尿激酶单位，固体发酵达每毫克20尿激酶单位，比野生的菌株高十多倍，并且生产原料易得，成本低，生产工艺稳定，生产周期短，所生产的纳豆激酶的活性高。
4．产品的稳定性明显好于已有的其他原料制成的的产品，在室温下，本产品每月取样一次，检验酶的活性，经过一年酶活性不变。在PH5—10的范围内，其性能十分稳定，并且本产品在50℃以内活性均不下降。
5．通过动静脉旁路血栓法检测的结果表明，加入纳豆激酶的小中大剂量组均与生理盐水对照组产生显著的差异，说明其对于抑制血栓形成有作用，其中特别是中大剂量组，与使用常规产品的对照组相比，有更明显的差异。这说明纳豆激酶除抑制血栓形成外，还具有溶栓效果。同时各剂量组之间具有依赖关系。根据对实验者血液中FIB(纤维蛋白原)、FDP(纤维蛋白降解产物)和D．diver的含量测定，纳豆激酶可以明显降低FIB的含量，使FDP显著增高，由此证实纳豆激酶具有xx纤溶酶的作用。报告附后。
6．经过国家认可的指定单位进行急性毒性检验，该产品符合人用药品的要
求。报告附后。
实施例1：
一种利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶，所述的菌种是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtitis)Hw4—1CGMCC．N00718，该菌种于2000年10月30日鉴定，并于2002年的2月27日送CGMCC保藏，其存活证明已经提交国家知识产权局。该蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶类，由275个氨基酸组成，分子量27730道尔顿，’等电点pl值为8．6。
其枯草芽孢杆菌的菌种特性为：
1．形态特征：于37℃培养l-2天后，菌体为短杆状，有时成链，直形，
2．培养特征：在LB培养基上37℃培养l-2天后，菌落呈乳脂色，边缘不光滑，表面粗糙，呈皱褶状，菌落不粘，易挑起。
3．生理生化特性：
接触酶十，氧化酶一，VP试验+，VP<pH6+，VP>Ph7一，明胶液化+，分解酪素+，淀粉水解一，硝酸盐还原+。利用碳水化合物产酸：葡萄糖+，木糖+，L一阿拉伯糖一，甘露醇+
实施例2：．
上述纳豆激酶的生产方法：
利用大豆蛋白胨等氮源、多糖类物质和无机盐进行发酵，发酵温度为36.5-37.5℃，发酵周期16-50小时，pH 6.5—7.5。经过离心、超滤后，将上清液中加入冷乙醇使其含量达70-80％，或者加固体硫酸铵使饱和度达60—70％，低温沉淀后离心，干燥粉碎，得到纳豆激酶的粗干粉，经凝胶层析后得到纯化产品。
上述的利用枯草芽孢杆菌培养产生上述纳豆激酶的方法，所述的氮源、多糖类物质和无机盐可以选择：
a．固体发酵：采用大豆作为发酵基质。
b．液体发酵：多糖类物质采用麦芽糖、木糖、蔗糖，使用量为：l-8％(重
量比)，{zj0}量为1.5-4％，或者利用麦芽汁作为碳源，增加0.1-2％(重量比)酵母膏，以提高纳豆激酶的产量。氮源采用大豆蛋白胨、豆饼粉，使用量l-10％(重量比)，其{zj0}量为2-5％，或者利用豆浆作为发酵物质。
c．所述的无机盐：KH2P04
发酵罐培养的条件：
通气量控制为：(1：0.5)一(1：1)V／V／min，搅拌200-400rpm，罐温为36.5-37.5℃之间，罐压为0.03-0.05Mpa．
发酵：
采用固体发酵时，应当精选大豆，泡24小时，121℃xx一小时，冷却后进行接种发酵。发酵的相对湿度为80-95％，温度为36-38℃，周期为20小时以上，一般不必超过50小时。
发酵后可以进行提取，用1-2倍量的含2mM CaCL2的生理盐水在低温下搅拌抽提1-2小时后，进行过滤，离心30-40分钟，弃沉淀，收集上清液，加入低温乙醇至乙醇含量达到70-80％，或加入固体硫酸铵至饱和度达到60—70％，低温过夜沉淀，离心后真空抽干，将沉淀粉碎，即得纳豆激酶的粗干粉。
如果采用的是液体发酵，则直接进行低温离心，除去菌体，并超滤浓缩1—10倍，加入低温乙醇至乙醇含量达到70—80％，或加入固体硫酸铵至饱和度达到60-70％，低温过夜沉淀，离心后真空抽干：将沉淀粉碎，即得纳豆激酶的粗干粉。
纯化：
将纳豆激酶粗干粉用Tris·HCL缓冲液溶解后，使用Butyl Sepharose4FF
疏水层析柱进行组分分离，收集高活性组分。透析浓缩后，用CM离子交换柱
分离，收集活性组分。反渗浓缩后，进行SephadexG．100分子筛凝胶柱层析，
收集活性组分。经透析浓缩后，得到纳豆激酶的纯化产品。
实施例3：
上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位5000U-10000U加入到淀粉或者糊精中，制成肠溶胶囊，用于xx血栓类的心脑血管疾病的药品。
每日3次，每次2粒。
实施例4：
一种上述的利用枯草芽孢杆菌生产的纳豆激酶的用途，将利用枯草芽孢杆
菌生产的纳豆激酶按照常用的酶单位加入到丹参粉、地龙粉中，其重量配比为：纳豆激酶l00-150万酶单位，丹参粉50克，地龙粉30克，共同制成纳米级微粒后，制成肠溶胶囊或者口服液，作为心血管疾病易发人群的保健品，用于预防血栓类的心脑血管疾病的药品。
纳豆激酶的生产
提供一种得率高，酶活高，成本低，可进行产业化生产的纳豆激酶的生产方法。
依次包括下述两个步骤：
一、发酵；
所述第的发酵是固体发酵，该发酵过程依次有如下工序，
①用特制浸泡液浸泡优质黄豆，所述的特制浸泡液的配方为：牛肉浸膏5～l0g，蛋白胨4～12g，酵母浸出汁3—8g，NaCl 5～l0g，葡萄糖l5～20g，自来水l000ml，PH值为6.8～7，浸泡到黄豆吸足水份，豆无硬心，表面无皱纹为止；
②装瓶xx接种：采用常规xx方法，等瓶温自然冷却至40℃以下，在无菌条件下接种，接种所用的菌种是枯草芽孢杆菌；
③培育：采用常规培养条件；
采用高低温培养方法，先在37℃下培养22—32小时后马上转入3～10℃条件下保温，l2～24小时获得发酵物。
二、将经发酵步骤后得到的干燥物粉碎；
①干燥：采用常规方法。
干燥工序中采用的是将发酵物进行低温真空冷冻干燥，发酵物水分小于l5％时干燥结束。
②粉碎是采用细胞破壁技术。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓xx，其特殊之处在于：制备片剂、冲剂、硬胶囊、软胶囊或口服液时，在所得产物中直接添加可溶性淀粉、葡萄糖、麦芽糊精(等)配料调整至每克内有200～680的酶活单位。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓xx每克内有200～380的酶活单位，具有预防心血管疾病的作用。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的纳豆激酶溶栓xx每克内有300～680的酶活单位，具有xx心血管疾病的作用。
上述生产方法培养的纳豆激酶制备的冻干粉每克内含大于800的酶活单位，制备的针剂纯度达95％以上。
下面将通过实施例对方案作详细叙述：
{dy}部分：纳豆激酶的生产方法
1、使用特制浸泡液的实施例及其与使用常规浸泡液的产物酶活比较实验条件：300ml三角瓶加入特制浸泡液浸泡过的大豆l0g，调PH7，121℃xx15min，接入枯草芽孢杆菌斜面菌种，在37℃条件下培养24小时，常规干燥、常规粉碎后测定酶活。
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浸泡液 |
例 |
牛肉浸膏 |
蛋白胨 |
酵母浸出液 |
NaCl |
葡萄糖 |
测定酶活 |
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常规浸 |
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2、高低温培养条件实施例及其与常规培养条件下的产物酶活比较：
实验条件：500ml三角瓶内加入经特制浸泡液浸泡过的大豆30g，调PH7，在121℃条件下xx30min接入枯草芽孢杆菌种子菌种培养，再经常规干燥、常规粉碎后测定酶活。
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测定酶活u／g | |
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常规培 养条件 |
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高低温 |
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培养条 |
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3、干燥与粉碎工序实施例，使用原料为经特制浸泡液浸泡，经高低温培养制得的发酵豆。
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常规方法粉碎 |
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常规方法粉碎 |
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由上述实施例可以看出，使用特制浸泡液、采用高低温培养条件、采用低温真空冷冻干燥及细胞破壁技术均对提高产物酶活有重要作用。
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例 |
{dy}部分最终产物 |
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可溶性淀粉 |
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预防 |
3g |
明显 |
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预防 |
3g |
明显 |
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预防 |
3g |
明显 |
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预防 |
3g |
明显 |
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可溶性淀粉 |
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xx |
3g |
明显 |
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xx |
3g |
明显 |
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xx |
3g |
明显 |
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xx |
3g |
明显 |
2次，每次3克。
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例 |
{dy}部分最终产物 |
调整酶活单位 |
作用 |
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具体的用量数，1日2次，每次3克，共6次，
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例 |
{dy}部分最终产物 |
调整酶活单位 |
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纳豆激酶的制造
提供了一种回收率较高的纳豆激酶的制造方法。
提供一种纳豆激酶的制造方法，其包括如下步骤：发酵，将纳豆激酶从纳豆菌释放出来，发酵液中含有纳豆激酶及菌体;将发酵液中纳豆菌细胞的细胞壁破碎，释放出发酵过程中，卡在细胞壁的纳豆激酶；将细胞壁破碎后的发酵液离心并收集上清液；纯化所述上清液，获得纯化后的纳豆激酶溶液。
提供的纳豆激酶的制造方法中，包括了细胞破碎的步骤，即将纳豆菌细胞的细胞壁破碎，将细胞壁破碎后，可以将在发酵过程中被卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶均释放出来。因此，相较于先前技术的纳豆激酶的制造方法，提供的纳豆激酶的制造方法可较大程度上提升纳豆激酶的回收率。而且，针对同一发酵方法，提供的纳豆激酶的制造方法可将纳豆激酶的回收率提升40～50％。
具体实施方式一：
1)发酵
从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入l0毫升的种子培养基中，150转／分钟(rpm)下摇床培养8小时，按l％接种量接入发酵培养基中，再于28℃、150转／分钟下发酵罐培养l00小时。发酵过程中，纳豆激酶会从纳豆菌中释放出来，液体中含有纳豆激酶及菌体。
2)细胞破碎
如上所述，在发酵过程中，纳豆激酶会从纳豆菌中释放出来。经研究表明，发酵只能释放出纳豆菌中所含有的部分纳豆激酶，约有50％左右的纳豆激酶受到纳豆菌细胞的细胞壁的阻碍，会卡在纳豆菌细胞的细胞壁而未能从纳豆菌细胞中释放出来，因此现有技术纳豆激酶的制造方法无法利用卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶，因此，总是无法达到理想的回收率。
为解决此问题，提供了细胞破碎的步骤，即将纳豆菌细胞的细胞壁破碎。将细胞壁破碎后，可以将先前技术中被卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶均释放出来，因此，可较大程度上提升纳豆激酶的回收率。
提供的细胞破碎步骤的{dy}种实施方式为：瞬间(一般为1秒以内)改变发酵液所处环境的压力，例如，可瞬间提升至2000磅／平方英寸(Psi)再瞬间降至常压，以使纳豆菌细胞壁破碎，此步骤重复进行，以使纳豆菌细胞充分破碎。
3)离心
用冷冻离心机将发酵液于O℃下以2000转／分钟(rpm)的速度离心8分钟，收集上清液，于上清液中加入l0％饱和度的硫酸铵(NH4)2s04沉淀，2000转／分钟离心收集上清液，继续在上清液中加入硫酸铵至60％的饱和度，2000转／分钟离心收集沉淀，将沉淀重悬于10毫摩尔浓度、pH值为6的磷酸缓冲液中，2000转／分钟离心l0分钟收集上清液，于o℃保存备用。
4)精制，即纯化
用层析系统将上清液以l0公分／小时(cm／h)的线速度加入凝胶层析柱中，用10毫摩尔浓度(mM)的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪于波长为280纳米和260纳米进行检测，收集保留体积为9毫升处的洗脱液，收集液体积为3毫升，此步骤可称作凝胶层析分离。
5)制成高纯度纳豆激酶产品
将精制步骤中收集得到的洗脱液放置于去离子水中进行透析脱盐l6小时后，置于．20℃冰箱下冷冻l2小时将其进行冷冻干燥，干燥时间为24小时，即可得到高纯度的纳豆激酶产品。
纳豆激酶的制造第二实施方式。
1)发酵
从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入200毫升的种子培养基
中，
基中，再于37℃、300转／分钟下发酵罐培养l50小时。
2)细胞破碎
本实施方式中，细胞破碎的步骤为：将发酵液反复冷冻，将温度降至
一1℃以下，形成水冰晶，以刺破纳豆菌细胞壁。
3)离心
用冷冻离心机将发酵液于20℃下以l0000转／分钟的速度离心15分钟，收集上清液，于上清液中加入40％饱和度的硫酸铵(NI-14)2S04沉淀，10000转／分钟离心收集上清液，继续在上清液中加入硫酸铵(NH4)2S04至85％的饱和度，
4)精制，即纯化
用层析系统将上清液以l00公分／小时(cm／h)的线速度加入凝胶层析柱中，用200毫摩尔浓度的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪于波长为280纳米和260纳米进行检测，收集保留体积为l5毫升处的洗脱液，收集液体积为6毫升，此步骤可称作凝胶层析分离。
5)制成高纯度纳豆激酶产品
将精制步骤中收集得到的洗脱液放置于去离子水中进行透析脱盐32小时后，置于一20℃冰箱下冷冻24小时将其进行冷冻干燥，干燥时间为48小时，即得到高纯度的纳豆激酶产品。
纳豆激酶的制造第三实施方式。
1)发酵
从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入50毫升的种子培养基中，240转／分钟(rpm)下摇床培养10小时，按4％接种量接入发酵培养基中，再于30℃、220转／分钟下发酵罐培养l20小时。
2)细胞破碎
本实施方式中，细胞破碎的步骤为：于发酵液中加入分解酶，以溶解纳豆菌细胞壁，此步骤中所述的分解酶可以选择溶酶体(Lysosome)或酰胺酶(Amidase)或葡糖苷酶(Glucosidase)等。
3)离心
用冷冻离心机将发酵液于4℃下以8000转／分钟(rpm)的速度离心10分钟，收集上清液，于上清液中加入20％饱和度的硫酸铵沉淀，8000转／分钟离心收集上清液，继续在上清液中加入硫酸铵至70％的饱和度，8000转／分钟离心收集沉淀，将沉淀重悬于70毫摩尔浓度(mM)、pH值为6.4的磷酸缓冲液中，8000转／分钟离心20分钟收集上清液，于4℃保存备用。
4)精制，即纯化
用层析系统将上清液以30公分／小时(cm／h)的线速度加入凝胶层析柱中，用40毫摩尔浓度(mM)的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪于波长为280纳米和260纳米进行检测，收集保留体积为1 0毫升处的洗脱液，收集液体积为5毫升，此步骤可称作凝胶层析分离。
5)制成高纯度纳豆激酶产品
将精制步骤中收集得到的洗脱液放置于去离子水中进行透析脱盐20小时后，置于．20℃冰箱下冷冻20小时将其进行冷冻干燥，干燥时间为40小时，即得到高纯度的纳豆激酶产品。
综上所述，提供的纳豆激酶的制造方法包括如下步骤：
1)发酵，将纳豆激酶从纳豆菌中释放出来，发酵液中含有纳豆激酶及
菌体，从固体培养基挑取表达纳豆激酶的单菌落接入l0～200毫升的种子培养基中，150～300转／分钟(rpm)下摇床培养8～25小时，按l％～5％接种量接入发酵培养基中，再于28～37℃、150～300转／分钟下发酵罐培养100～150小时；
2)细胞破碎，即将纳豆菌细胞的细胞壁破碎
提供的细胞破碎步骤的{dy}种实施方式为：瞬间(一般为1秒以内)改变发酵液所处环境的压力，例如，可瞬间提升至2000磅／平方英寸(Psi)再瞬间降至常压，以使纳豆菌细胞壁破碎，此步骤重复进行，以使纳豆菌细胞破碎充分；
提供的细胞破碎步骤的第二种实施方式为：将发酵液反复冷冻，将温度降至一l℃以下，形成水冰晶，以刺破纳豆菌细胞壁；
提供的细胞破碎步骤的第三种实施方式为：于发酵液中加入分解酶，以溶解纳豆菌细胞壁，此步骤中所述的分解酶可以选择溶酶体或酰胺酶或葡糖苷酶等；
而且提供的纳豆激酶的制造方法中，细胞破碎的步骤并不限于上述三种细胞破碎的方式；
3)离心
用冷冻离心机将发酵液于0～20℃下以2000～10000转／分钟(rpm)的
速度离心8～15分钟，收集上清液，于上清液中加入l0～40％饱和度的硫
酸铵沉淀，2000～10000转／分钟离心收集上清液，继续在上清液中加入硫酸铵至60～85％的饱和度，2000～10000转／分钟离心收集沉淀，将沉淀重悬于l0～100毫摩尔浓度、pH值为6～8的磷酸缓冲液中，2000～10000转／分钟离心10～30分钟收集上清液，于0～20℃保存备用；
4)精制，即纯化
用层析系统将上清液以l0～100公分／小时(cm／h)的线速度加入凝胶层析柱中，用l0～200毫摩尔浓度的磷酸缓冲液以相同的线速度洗涤至出峰完毕，用紫外检测仪于波长为280纳米和260纳米进行检测，收集保留体积为9～15毫升处的洗脱液，收集液体积为3～6毫升，此步骤可称作凝胶层析分离：
5)制成高纯度纳豆激酶产品
将精制步骤中收集得到的洗脱液放置于去离子水中进行透析脱盐l6～32小时后，置于一20℃冰箱下冷冻l2～24小时将其进行冷冻干燥，干燥时间为24～48小时，即得到高纯度的纳豆激酶产品。
另外，的发酵、离心、纯化以及制成高纯度纳豆激酶产品的步骤并不限于上述实施方式所述，可以采用任何一种现有技术所提供的方法。
如上所述，提供的纳豆激酶的制造方法中，包括了细胞破碎的步骤，即将纳豆菌细胞的细胞壁破碎，将细胞壁破碎后，可以将在发酵过程中被卡在纳豆菌细胞壁的纳豆激酶均释放出来。因此，相较于现有技术的纳豆激酶的制造方法，提供的纳豆激酶的制造方法可较大程度上提升纳豆激酶的回收率。而且，针对同一发酵方法，提供的纳豆激酶的制造方法可将纳豆激酶的回收率提升40～50％。
纳豆激酶生产方法
提出的采用纳豆芽孢杆菌产生纳豆激酶的生产方法及其用途属于微生物技术领域，特别涉及到高产菌株发酵和酶的生产方法。
日本采用液体发酵方法生产纳豆激酶，其发酵培养基组成为：
2％果糖、l．5％大豆蛋白胨、0．2％酵母浸出物、0．1％KH2P04、0．3％K2HP04、0．05％MgS04·5H20、0．02％CaCl2·2H20，发酵温度3 0℃、40小时。所述纳豆激酶活性单位为0．42．1．48u／ml。
培养产生纳豆激酶的生产方法，其特征在于：
1)纳豆芽孢杆菌在大豆或大豆制品为主要培养基上进行固体或液体发酵；
2)固体发酵或液体发酵
固体发酵：
采用水发黄豆破碎或不破碎，xx后直接进行接种进行发酵，豆饼粉、
豆渣、脱脂大豆粉也可用做发酵原料；发酵时温度控制为22-40℃，{zj0}
温度为36—38℃，相对湿度控制为80一95％，发酵周期为18-60小时；
液体发酵：
采用豆乳做发酵基质，可稀释或不稀释进行发酵；利用大豆粉、豆饼粉、豆渣使用量为l-8％，{zj0}用量为2-5％；添加牛肉膏或玉米浆可以促进纳豆芽孢杆菌X-501对纳豆激酶的分泌，牛肉膏使用量为0.2-2％，{zj0}为1—1.5％玉米浆使用量为0.5-1.5％，{zj0}为0.5—1.O％；发酵时温度控制为22-40℃，{zj0}温度为36-38℃，发酵周期18-48小时，pH值控制为6.8-7.0；
试验时摇瓶培养条件：
500ml三角摇瓶，培养基装量60-100ml，当偏心距为2.54cm的旋转摇床时，转数250-350rpm，当采用偏心距为5.0cm的旋转摇床时，转数为180—240rpm；
生产时发酵罐培养条件：
通气控制为1：0.4-1 :1v／v／min，搅拌200—300rpm，罐温36-38℃，罐压0.03—0.05MPa：
3)提取
对于固体发酵，先用5-10倍量的0.1-0.15M的氯化钠溶液在4-10℃下搅拌抽提l-2小时后先粗预滤，除去大颗粒发酵基质，压滤或离心去xx体；滤液或上清液中加0.O2-0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以便纳豆激酶沉淀下来；
对于液体发酵，则直接进行压滤或离心除去菌体；滤液或上清液中加
0.02—0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以便纳豆激酶沉淀下来；
4)纯化
经75％的酒精沉淀或固体硫酸铵沉淀出来的沉淀物用0.05M PH7.6的
磷酸缓冲液溶解，加入固体硫酸铵逐渐达80％饱和度，高速离心，收集沉
淀物。沉淀物用0.05M PH6．5磷酸缓冲液溶解并透析，在CM32离子交换柱上层析，收集活性组分。该组分进行超滤浓缩，得到高浓度的酶液，再进行SephacrylS—l00HR凝胶柱层析，收集活性组分，该组分经超滤浓缩透析而得到纳豆激酶的纯化产品。
纳豆芽孢杆菌X．501的生产方法如下：
菌株在大豆或大豆制品(包括大豆粉，豆饼粉，脱脂大豆粉，豆渣，豆乳等)为主要基质的培养基上进行固体或液体发酵。
发酵
对于固体发酵可用水发黄豆经破碎或不破碎，经xx后，直接接种进行发酵。豆饼粉、大豆粉、豆渣、脱脂大豆粉也可用作为发酵原料，发酵时温度控制为22—40℃，最适温度36—38℃相对湿度控制为80—95％，发酵周期为18—60小时。
对于液体发酵还可用豆乳作为发酵基质可经稀释或不稀释进行发酵。利用大豆粉、豆饼粉、豆渣等使用量为1—8％，{zj0}用量为2—5％。液体发酵时添加牛肉膏或玉米浆可以促进纳豆菌对纳豆激酶的分泌，玉米浆使用量0.5一1.5％，{zj0}用量0.5一1.O％；牛肉膏0.5—2％，最适用量l—1.5％。液体发酵时温度可控制在22—40℃，最适温度36—38℃，发酵周期18—48小时。PH值可控制在6.8—7.0。
试验时摇瓶培养条件：
500ml三角摇瓶，培养基装量60-100ml，当采用偏心距为2.54cm的旋转摇床时，转数250-350rpm，当采用偏心距为5.0cm的旋转摇床时，转数为l80-240rpm；
生产时发酵罐培养条件：
通气控制为1：0.4-1：1v／v／min，搅拌200-300rpm，罐温36- 38℃，罐压0.03-0.05MPa；
纳豆激酶的提取：
对于固体发酵可先用5—10倍量的0.1—0.15M的氯化钠液在4—10℃下搅拌抽提1—2小时后先粗预滤，除去大颗粒发酵基质，压滤或离心去xx体。对于液体发酵则直接进行压滤或离心除去菌体。滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以使纳豆激酶沉淀下来。
对于液体发酵，则直接进行压滤或离心除去菌体，滤液或上清液中加0.02-0.05％CaCl2，并在低温下再进行超滤浓缩20-50倍，加冷酒精至乙醇含量达75-80％，或加固体硫酸铵使饱和度逐渐达80％，以使纳豆激酶沉淀下来。
纳豆激酶的纯化：
经75％酒精沉淀或固体硫酸铵沉淀出来的沉淀物用0.05M PH7.6磷酸缓冲液溶解，加入固体硫酸铵逐渐达80％饱和度。高速离心，收集沉淀物。沉淀物用0.05M PH6.5磷酸缓冲液溶解并透析，在CM3 2离子交换柱上层析，收集活性组分。该组分进行超滤浓缩，得到高浓度的酶液，再进行Sephacryl S-100HR凝胶柱层析，收集活性组分，该组分经超滤浓缩透析而得到纳豆激酶的纯化产品。纳豆激酶的用途：
纳豆激酶沉淀物溶解脱盐后可直接与其他辅料(豆粉、奶粉、豆奶粉及糊精等)混合调配至所要求的酶活单位，经冷冻干燥后制成纳豆激酶胶囊或其它形式的保健食品，也可将纳豆激酶沉淀物脱盐后直接进行冷冻干燥，再用少量葡萄糖或乳糖调配至所要求的酶活单位制成保健食品。
采用的生产原料简单，价格便宜，并且工艺参数合理。因此，可以在最短的生产时间内获得较高的产酶量。
实施例1：
500ml三角瓶加入3.2g大豆粉，l.2g牛肉膏，80m1自来水，调pH 6.9，121℃xx15min，接入10’纳豆芽孢杆菌X．501孢子液0.8ml．。在偏心距2.54cm旋转式摇瓶机中，旋转速度300rpm，38℃恒温培养28小时测得酶活7.6u／ml。
实施例2：
500ml三角瓶加入4.09生大豆饼粉，l.59牛肉膏，l00m1自来水，调pH 6.9，121℃xxl5min，接入10 5纳豆芽孢杆菌X-501孢子液1.0ml，在偏心距2.54cm旋转式摇瓶机中，旋转速度300rpm，38℃恒温培养30小时测得酶活2.5u／ml。
实施例3：
100g经水浸泡过夜的大豆，装入一只φ16cm平皿中(记作：A)，另取100g同样处理的大豆，经碾碎放入另一个φ16cm平皿中(记作：B)，121℃xx20min，冷却后各接入10 5纳豆芽孢杆菌X-501孢子悬液2.0ml。搅拌后置37℃恒温室，控制湿度90％，培养24小时。从A、B两平皿中各取l.0g，分别溶于5ml生理盐水中，浸提过夜，其溶纤活力分别为每克培养物A：22．9u和B：12.1u。
实施例4：
液体发酵工艺
将一支纳豆芽孢杆菌X-501活化斜面菌种用10ml无菌水洗脱后接入300L发酵罐中(培养基装量为250L)。发酵培养基组分为：大豆粉4％，牛肉膏1.5％，自来水补足体积至250L，121℃xx30分钟，xx后PH为6.7-7.0，发酵温度为38℃，搅拌速度250rpm，通气量为1：O.7v／v／m，发酵时间为30小时，发酵单位最终为8.5u／ml。
实施例5：
提取工艺，纳豆激酶胶囊制取
250L发酵液经离心除去菌体，然后上清加CaCl2
实施例6：
纯化工艺，纳豆激酶医用注射针剂的制取
将由300L发酵罐上得到的一批250L发酵液(发酵单位9.1u／ml)按实施例5提取工艺提取得乙醇沉淀物溶解后，再经硫酸铵沉淀，收集沉淀物再进行透析脱盐。透析后的酶液先经羧甲基纤维素CM32阳离子交换柱层析，收集高活性组分，经超滤液浓缩至小体积。再经SephacrylS．100HR凝胶柱层析，收集高活性组分，经超滤浓缩后进行冷冻干燥，制成医用注射针剂。
超滤法制备纳豆激酶
将纳豆发酵液进行预处理，降低黏度及杂质，用超滤器进行浓缩，除去部分小分子杂蛋白、色素及无机盐，用离子交换树脂进行交换，进一步除去杂蛋白，{zh1}进行冷冻干燥，获得纯度较高的纳豆激酶。
( 1 ）工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 预处理
取定量纳豆发酵液，置于沉淀罐中，在搅拌下缓慢加入浓度为20 % ( 200g / L ）的CaCI2溶液，CaC12 溶液用量约为发酵液体积的0.5 %。然后，3000 ～ 5000r / min 离心10 ～ 20min ，收集上层液用浓度为30 % ( 300g / L ) 碳酸钠 ：调节pH 值为7.5 ，再次离心，收集上层清液备用。通过该处理，蛋白质回收率为65.2 % ，降低34.8%；酶活力收得率为90.7% ，降低10.3%。
② 超滤浓缩
将收集的离心上层清液进行冷却，使温度降低至4 ℃ ，然后泵入超滤机，用截留分子量1 0000 的超滤膜进行超滤浓缩，在浓缩过程中不断加蒸馏水以降低离子强度。待浓缩液电导率约为800 μS / cm 时停止超滤，此时浓缩倍数约为10 倍。通过超滤，酶活力回收率为89.34 % ，仅损失1 .5 % ，而蛋白质回收率为57 % ，降低7.2 ％。
③ 色谱精制
将超滤浓缩液上CM-52 柱，控制流出速度为50mL / min ，先用浓度为0.005mol / L 、pH 值为8.0的磷酸缓冲液洗脱至基线后，接着用浓度为0.02mol / L 、pH 值为10 的磷酸缓冲液洗脱，收集洗脱活性峰进行冷冻干燥，获得纳豆激酶冻干粉。冷冻干燥条件为：温度-60 ～-50 ℃ ，真空度为25～50Pa ，时间为24h 。通过该处理，蛋白质损失率达80.2 % ，酶活力损失26.46 ％。若要获得比活力更高的纳豆激酶制品，可以将洗脱液进行分子筛色谱后进行冻干。
( 3 ）主要指标
活力回收为65.7 % ，蛋白质回收率为17 % 。
固体发酵制纳豆激酶
用固态法发酵纳豆，是传统的制备豆豉方法，虽然原料利用率较低，但是发酵条件较简单，实用性较强。
( l ）工艺流程
( 2 ）主要步骤
① 分离枯草芽孢杆菌菌种
枯草芽孢杆菌菌株：从25 批市售豆豉中筛选出形态良好的10 株枯草芽孢杆菌，经发酵实验，获得1 株产纤溶活性蛋白酶{zg}的菌株，批号为031201 。
② 制备平板分离培养基
取2 份酵母粉、0.4 份麦芽糖、0.7 份NaH2PO4、0.5 份NaCI 、2 份琼脂粉，用去离子水稀释成100 份。置于高压锅中，在121 ℃ xx30min 后冷却至常温，然后在无菌条件下接入豆豉浸出溶液，37 ℃ 培养24h ，获得1 株产纤溶活性蛋白酶{zg}的菌株，批号为031201 。
③ 扩大培养
配制试管斜面培养基。取1 份蛋白胨、0.5 份NaCI 、0.1 份K2 HPO4、2 份琼脂粉、50份肉汤，用去离子水稀释成100 份。置于高压锅中，在121 ℃ xx30min 后冷却至常温，然后在无菌条件下接入批号为031201 的菌株，于37 ℃ 培养24h ，获得扩大培养菌种。
④ 生产菌种培养
配制三级扩大种子。取0.3 份Na2 HP04、0. 03 份KH2PO4、0.05 份MgSO4、0.5 份麦芽糖、2.0 份酵母粉，置于锥形瓶中，在高压锅中于121 ℃ xx30min 后冷却至常温，然后在无菌条件下接入扩大培养菌种，于37 ℃ 、200r / min 转速下培养6h ，获得液体生产菌种。
⑤ 接种
称取定量黄豆，洗净后浸泡过夜，次日捞出，置于甑子中蒸煮50min （以甑子下水温度达到沸腾时计）。然后取出，置于接种锅中，待其温度降低至35-40 ℃ 时，加入培养好的种子液，进行搅拌，接种量的体积（mL ）为黄豆质量（g ）的10 ％。{zh1}，将接种完成的黄豆置于木质或竹质等浅盘中进行发酵，发酵物料的厚度为10 - 15cm 。
⑥ 发酵在发酵室中，将盛有发酵物料的浅盘置于发酵架上，控制温度为37 ℃ ，发酵时间为24h ，获得富含纳豆激酶的豆豉。
( 3 ）主要指标
发酵豆豉中纳豆激酶活力为1931 IU / g 。
制备纳豆激酶必须先行发酵，液体发酵养分利用率高，纳豆激酶溶解于发酵液中，容易分离，因此更适合于大规模生产。
固态发酵制剂
提供一种固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法，选用从纳豆中筛选出合适的纳豆芽孢杆菌并提出该菌株固态发酵生产微生态制剂的方法。
固态发酵制备纳豆芽孢杆菌微生态制剂的制备步骤为：
1)菌株为纳豆芽孢杆菌；
2)一级种子培养：
液体种子培养基以g/l计为：蛋白胨10、牛肉膏5、NaCl 5，pH 7.0～7.2；
培养条件：将纳豆芽孢杆菌接种于肉汤培养基斜面，37℃培养24h；挑取1环斜面种子接种于液体种子培养基，于旋转式摇床200rpm，37℃培养l6h，得到一级种子液；
3)二级种子培养：
培养条件：于5～50L的种子发酵罐中装入70％体积的液体种子培养基，l21℃xxl5min，冷却至37℃，接种l％～2％上述一级种子液，37℃培养10～18h，得到二级种子液；
4)固态培养：
配制固态发酵培养基：将5～8份麸皮，l～4份豆饼粉，1～4份玉米淀粉混和均匀，按照固一液重量比l：O.9-1.4的比例加入含K2HP04·3H20
培养条件：固态发酵培养基中接种1％～4％上述二级种子液，充分拌匀，在密闭的固态发酵罐中，37℃保温保湿发酵32～40h，得到湿发酵曲；
5)添加载体并干燥：在上述湿发酵曲中加入重量比为l0～20倍的玉米淀粉，充分拌匀，于50～80℃的热风中干燥3～15h，得到干燥发酵曲；
6)粉碎：将上述干燥发酵曲粉碎，过40～60目筛，得到纳豆芽孢杆菌微生态制剂。
经过上述步骤生产的纳豆芽孢杆菌微生态制剂具有耐高温、耐酸碱、耐胆汁的特点，并具有较好的贮存稳定性。微生态制剂产品中的活菌总数为l.0x10*10～2.0x10*10 cef／g。纳豆芽孢杆菌还具有产纤溶酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力，在步骤4)得到的湿发酵曲含有一定量的纤溶酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶。
有益效果：由于本固态发酵生产纳豆芽孢杆菌微生态制剂的方法是在一种密闭式固态发酵反应器中进行的，且整个发酵过程遵循无菌操作规程，从而使纳豆芽孢杆菌的固态发酵生产实现了严格意义上的纯种培养，并实现大规模放大生产。涉及的固态发酵培养基解决了以豆粕为主要原料存在的高粘性等问题，大大提高了纳豆芽孢杆菌的产量，发酵产品的活菌数达到20x10*11cef／g以上，且具有较高的芽孢率，经载体稀释后达到1×10 10～2x10*10 cef／g。且生产成本低，产品质量稳定高效，生产过程无三废产生，属清洁生产工艺。
实施例1：
纳豆芽孢杆菌微生态制剂的固态发酵方法
将纳豆芽孢杆菌接种于肉汤培养基斜面，37℃培养24h。挑取l环斜面种子接种于液体种子培养基(蛋白胨1％、牛肉膏0.5％、NaCl 0.5％，pH 7.0～7.2)，于旋转式摇床200r.P.m，37℃培养l6h，得到一级种子液。
于50L的种子发酵罐中装入35L液体种子培养基，l21℃xx15min，冷却至37℃，接种1.5％一级种子液，37℃培养10h，得到二级种子液。
6.5份麸皮，2份豆饼粉，1.5份玉米淀粉混和均匀，按照固．液重量比l：1.2的比例加入无机盐溶液(溶液中含K2HP04.3H20
固态发酵培养基中接种l.5％上述二级种子液，充分拌匀，在密闭的固态发酵罐中，37℃保温保湿发酵40h左右，得到湿发酵曲。其发酵过程曲线见图1。在湿发酵曲中加入重量比为15倍的玉米淀粉，充分拌匀，于55℃的热风中干燥6h，得到干燥发酵曲。将干燥发酵曲粉碎，过60目筛，得到纳豆芽孢杆菌微生态制剂。
实施例2：
纳豆芽孢杆菌{zj0}固态发酵培养基的确定
(1)氮源的确定：
将底物麸皮固定为8份，与不同的氮源混和均匀，按照固一液重量比l：1.2的比例加入无机盐溶液(溶液中含K2HP04.3H20
选用豆饼粉是较适合的氮源。
表1不同氮源对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响
氮源
豆饼粉
硫酸铵
硝酸钠
蛋白胨
酵母膏
(2)豆饼粉添加量的确定：
将3～9份麸皮与不同添加量的豆饼粉混和均匀，其余操作条件同(1)，取样检测活菌总数。结果如表2所示，
较适合的添加比例为2份豆饼粉加8份麸皮。
表2豆饼粉浓度对对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响
豆饼粉添加比例(份)
1
2
3
4
5
6
7
(3)碳源的确定：
将7.5份麸皮、2份豆饼粉和O.5份不同碳源混和均匀，其余操作条件同(1)，取样检测活菌总数。结果如表3所示，
玉米淀粉是最适合的碳源。
表3不同碳源对纳豆芽孢杆菌ICCTCC M207147固态发酵的影响
碳源
葡萄糖
乳糖
果糖
蔗糖
玉米粉
玉米淀粉
对照
(4)玉米淀粉添加量的确定：
将6～8份麸皮、2份豆饼粉和不同添加量的玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同(1)，取样检测活菌总数。结果如表4所示，
玉米淀粉最适合的添加量为：1.5份玉米淀粉加6.5份麸皮。
表4不同玉米淀粉添加量对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响.
玉米淀粉的添加比例(份)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
(5)加水比的确定：
将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，按照固一液重量比l：O.9-1.4的比例加入无机盐溶液拌匀，其余操作条件同(1)，取样检测活菌总数。结果如表5所示，
最适合的加水比为1：1.2。
表5不同加水比对纳豆芽孢杆菌固态发酵的影响
加水比
1：0.9
1：1.O
1：1.1
1：1.2
1：1.3
1：1.4
(6)无机盐浓度的确定：
将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同(1)，
最适合的K2HP04浓度为1.O％、MgS04浓度为0.1％。
表6无机盐浓度对纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147固态发酵的影响
K2HP04浓度(％)
0.3
0.5
1.0
0.5
0.5
实施例3：
纳豆芽孢杆菌{zj0}固态发酵条件的确定
(1){zj0}发酵温度的确定：
将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，按照固一液重量比1：1.2的比例加入无机盐溶液(溶液中含K2HP04.3H200.5％，MgS04.7H20
最适合的固态发酵温度为37℃。
(2){zj0}发酵pH的确定：
将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同实施例5(1)，取样检测活菌总数。结果如图7所示，
最适合的固态发酵pH为5.5～6.5，即自然pH。
实施例4：
发酵时间对纳豆芽孢杆菌芽孢率的影响
芽孢杆菌产芽孢后，可大大提高其对恶劣环境的耐受能力。为了提高纳豆芽孢杆菌制剂的加工性能以及对动物消化系统环境的适应性，一般要求芽孢杆菌制剂既要具有较高的活菌数又要具有较高的芽孢率(大于80％)。将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同实施例1(1)，37℃保温保湿发酵50h左右，在发酵过程中每间隔一定的时间取样测定其活菌数和芽孢率，结果如图8所示，
发酵40h后芽孢率超过80％。
实施例5：
纳豆芽孢杆菌的产酶能力
将6.5份麸皮、2份豆饼粉和1.5份玉米淀粉混和均匀，其余操作条件同实施例1(1)，37℃保温保湿发酵40h左右，监测湿发酵曲中的纤溶酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶活力，结果如表7所示，
纳豆芽孢杆菌具有一定的产纤溶酶、蛋白酶、淀粉酶和纤维素酶的能力。
表7纳豆芽孢杆菌CCTCC M207147的产酶能力
纤溶酶
酶活力(U／g干曲)
固体发酵批量培养
固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的方法，其特征在于，操作步骤：
第l步：配制固体培养基
按该培养基的重量百分比配方，黄豆饼粉2～60％、玉米粉2～60％、米糠2～40％、麸皮2～40％、硫酸铵0.4％和氯化铵O.2％，称取固体原料，将硫酸铵和氯化铵溶于重量为固体原料总重量的30～40％的水中，再与其余固体原料混和，搅拌均匀，均分为四份，分别投入四个固体发酵罐，制成相同的固体培养基四罐；
第2步：xx
在压力、温度和发酵罐转速分别为1.O5～1.3kg／cm2、121～125℃和6～60rph的条件下，对四罐固体培养基进行高压xx处理，处理时间为30～60分钟；
第3步：接种培养
罐温降至40～50℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入重量为每罐中固体原料重量的30～40％的无菌水，当罐温降至30～40℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株的xx种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为每罐固体原料重量的2～3％，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.2～0.8 kg／c m 2、 1600～2000 L／h、6～60rph和30～40℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养20～50小时：
第4步：收获活菌
经上步处理，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获大量枯草芽孢杆菌变异菌株的湿菌体，每种湿菌体的重量与投入每罐内固体原料和水的重量相等，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
具有以下突出效果：
1．每罐收获的湿菌体的重量大致与投入每罐中固体原料和水的重量相等，不仅湿菌体得率高，而且湿菌体不需要专门的离心机就能收集到，有助于大幅度减少设备投资。
2．收获的活菌数多，如用500L液体培养罐采用液体培养法培养，仅能获得湿菌体30～35kg，如改用的方法培养，收获湿菌体以210kg计，那末用的方法培养，收获的湿菌体约是液体培养法的6～7倍；
3．发酵培养过程不产生废液，无废液排放和环境污染问题。
实施例1。
一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的操作步骤：
第l步
为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为120kg的固体原料，其中黄豆饼粉36kg、玉米粉36kg、米糠24kg、麸皮23.28kg、硫酸铵0.48kg和氯化铵0.24kg，将硫酸铵和氯化铵溶于42kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；
第2步
在压力、温度和发酵罐转速分别为1.3kg／cm2、125℃和60rph条件下，对四罐固体培养基进行高压xx处理，处理时间为55分钟；
第3步
罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入42kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株的xx种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为3kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为07kg／cm2、2000L／h、60rph和3 7℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养48小时；
第4步
经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢杆菌变异菌株的湿菌体210kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
实施例2。
一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的操作步骤：
第l步
为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为60kg的固体原料，其中黄豆饼粉3kg、玉米粉33 kg、米糠20.64kg、麸皮3kg、硫酸铵0.24kg和氯化铵0.12kg，将硫酸铵和氯化铵溶于19.2kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；
第2步
在压力、温度和发酵罐转速分别为1.05kg／cm2、121℃和6rph条件下，对四罐固体培养基进行高压xx处理，处理时间为35分钟；
第3步
罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入19.2kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株的xx种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为1.2 kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为0.3 kg／cm2、l600L／h、6rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养24小时；
第4步
经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢杆菌变异菌株的湿菌体lOOkg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
实施例3。
一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的操作步骤：
第1步
为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为90kg的固体原料，其中黄豆饼粉4.5kg、玉米粉49.5kg、米糠4.5kg、麸皮30.96kg、硫酸铵0.36kg和氯化铵0.18kg，将硫酸铵和氯化铵溶于28.8kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；
第2步
在压力、温度和发酵罐转速分别为1.05kg／cm2、121℃和30rph条件下，对四罐固体培养基进行高压xx处理，处理时间为40分钟；
第3步
罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入28．8kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株的xx种子分别接入．上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为2.7kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为O.5 kg／cm2、1800L／h、30rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养36小时；
第4步
经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢杆菌变异菌株的湿菌体l50kg，每克湿菌体含活菌数20亿～5 0亿个。
实施例4。
一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的操作步骤：
第1步
为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为60kg的固体原料，其中黄豆饼粉33kg、玉米粉3kg、米糠20.64kg、麸皮3kg、硫酸铵0.24kg和氯化铵0.12kg，将硫酸铵和氯化铵溶于22.8kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；
第2步
在压力、温度和发酵罐转速分别为1.3kg／cm2、125℃和6rph条件下，对四罐固体培养基进行高压xx处理，处理时间为3 5分钟；
第3步
罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入22.8kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株的xx种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为1.2kg，
第4步
经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢杆菌变异菌株的湿菌体l07kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
实施例5。
一种固体发酵批量培养枯草芽孢杆菌变异菌株的操作步骤：
第1步
为四个容量为500L的固体发酵罐配制固体培养基，向每罐投入重量为90kg的固体原料，其中黄豆饼粉49.5kg、玉米粉4.5kg、米糠4.5kg、麸皮30.96kg、硫酸铵0.36kg和氯化铵0.18kg，将硫酸铵和氯化铵溶于34.2kg的水，注入每罐，搅拌均匀，配制成相同的固体培养基四罐；
第2步
在压力、温度和发酵罐转速分别为1.3kg／cm2、125℃和30rph条件下，对四罐固体培养基进行高压xx处理，处理时间为40分钟；
第3步
罐温降至40℃时，在发酵罐旋转的情况下，向每罐喷入34.2kg的无菌水，当罐温降至37℃时，将预先经二级培养成的处于对数生长期的枯草芽孢杆菌变异菌株的xx种子分别接入上二步所述的四个发酵罐，每罐的接种量为2.7kg，在罐压、通风量、发酵罐转速和罐温分别为O.5 kg／cm2、1800L／h、30rph和37℃的条件下，对四罐变异菌株连续发酵培养36小时；
第4步
经上步处理后，上述变异菌株大量繁殖，从四个发酵罐分别收获枯草芽孢杆菌变异菌株的湿菌体l61 kg，每克湿菌体含活菌数20亿～50亿个。
用豆粕固态发酵
提供一种利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法。
利用豆粕生产纳豆芽孢杆菌饲料添加剂的固态发酵方法的步骤为：
1)将纳豆芽孢杆菌斜面保存或甘油冻存的菌种，用KMB培养基，37℃、250rpm摇瓶培养l6 h，得到一级菌种液；
2)将粒度为80目重量百分比为1-5％的豆粕粉、1-3％的玉米淀粉、1-2％的玉米浆、0.2-0.8％的NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至6.5—7.0，补水，121℃高压xx15 min，接入2—6％的上述一级菌种液，37℃培养12—18 h，得到二级菌种液；
3)用pH值为5.5—8.5的水浸泡豆粕1-2 h，泡胀豆粕含水量为55-70％，
再添加重量百分比为0.3—1.2％的NaCl，3-5％的碳源葡萄糖、蔗糖或玉米淀粉，3—5％的氮源明胶或(NH4)2S04、脲或明胶，混匀，经过蒸煮xx，冷却，得到固态培养基；
4)固态培养基中接种5—10％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，30—37℃保温保湿发酵10—18 h，得到发酵豆粕；
5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为50—200％的xx玉米粉，充分拌匀，经45—80℃热风烘14—18 h至干燥，得到干燥发酵豆粕；
6)将上述干燥发酵豆粕用饲料粉碎机粉碎，过40—60目筛，得到纳豆芽孢杆菌饲料添加剂。
所述的步骤2)将粒度为80目重量百分比为5％的豆粕粉、l％的玉米淀粉、1.5％的玉米浆、0.2％的NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至7.0，补水，121℃高压xx15 min，接入4％的上述一级菌种液，37℃培养24 h，得到二级菌种液。
步骤3)用pH值为7的水浸泡豆粕l h，泡胀豆粕含水量为60％，添加重量百分比为0.9％的NaCl，5％的碳源葡萄糖，5％的氮源明胶，混匀，经过蒸煮xx，冷却，得到固态培养基。
步骤4)固态培养基中接种5％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，37℃保温保湿发酵l6h，得到发酵豆粕。
步骤5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为200％的xx玉米粉，充分拌匀，经55℃热风烘l6 h至干燥，得到干燥发酵豆粕。
豆粕经过发酵，使原有抗营养因子得到降解，部分大分子蛋白质被降解分子量小于l000的小肽，维生素K2、B2、吡啶二羧酸等营养和功能成分比发酵前增加数倍。
由于产品所含纳豆菌具有耐热、耐酸碱、好氧、繁殖快、能形成芽孢的特点，活菌质量稳定，每克含活菌总数为7.0—10.0×10*8cfu／g，符合农业部规定的纳豆芽孢杆菌饲料添加剂活菌总数1×10*8cfu／g的标准。
为一种不含xxx的益生菌饲料添加剂，在断奶仔猪常规饲料中添加2％一4％，具有促进仔猪的生长，提高日增重，提高采食量，降低料重比，促进益生菌乳酸杆菌的生长，抑制有害菌大肠杆菌生长的功能。
具体实施方式
通过以下实施例进一步详述，但不限于本实施例。
实施例1
1)将纳豆芽孢杆菌斜面保存或甘油冻存的菌种，用KMB培养基(KMB培养
基配方：NaCl 8.0g，Na2HP04·l2H20 2.9g，K2HP04
2)将粒度为80目、重量百分比为3％的豆粕粉，l％的玉米淀粉，1％的玉米浆，0.2％的NaCl溶于水溶液。经双层纱布过滤，调节pH值至6.5，补水，l21℃高压xx15 min，接入2％的上述一级菌种液，37℃培养l2 h，得到二级菌种液；
3)用pH值为5.5的水浸泡豆粕l h，泡胀豆粕含水量为55％，再添加重
量百分比为0.3％的NaCl，3％的碳源葡萄糖，3％的氮源明胶，混匀，经过蒸煮xx，冷却，得到固态培养基；
4)固态培养基中接种5％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，30℃保温保湿发酵l0 h，得到发酵豆粕；
5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为50％的xx玉米粉，充分拌匀，
经45℃热风烘l4 h至干燥，得到干燥发酵豆粕；
6)将上述干燥发酵豆粕用饲料粉碎机粉碎，过40目筛，得到纳豆芽孢杆
菌饲料添加剂。
实施例2
1)将纳豆芽孢杆菌斜面保存或甘油冻存的菌种，用KMB培养基摇瓶培养，37℃、250 rpm摇瓶培养l2 h，得到一级菌种液；
2)将粒度为80目重量百分比为5％的豆粕粉、2％的玉米淀粉、1.5％的玉米浆、0.5％的NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至7.0，补水，l21℃高压xxl5 min，接入4％的上述一级菌种液，37℃培养l4 h，得到二级菌种液；
3)用pH值为8.5的水浸泡豆粕2 h，泡胀豆粕含水量为70％，再添加重
量百分比为1.2％的NaCl，5％的碳源蔗糖，5％的氮源(NH4)2S04，混匀，经过蒸煮xx，冷却，得到固态培养基；
4)固态培养基中接种7.5％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，37℃保温保湿发酵l8 h，得到发酵豆粕；
5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为200％的xx玉米粉，充分拌匀，经60℃热风烘15 h至干燥，得到干燥发酵豆粕；
6)将上述干燥发酵豆粕用饲料粉碎机粉碎，过60目筛，得到纳豆芽孢杆
菌饲料添加剂。
实施例3
1)将纳豆芽孢杆菌斜面保存或甘油冻存的菌种，用KMB培养基摇瓶培养，37℃、250 rpm摇瓶培养l4 h，得到一级菌种液；
2)将粒度为80目重量百分比为7％的豆粕粉、3％的玉米淀粉、2％的玉米浆、0.8％的NaCl溶于水溶液，经双层纱布过滤，调节pH值至7.0，补水，l21℃高压xx15 min，接入6％的上述一级菌种液，37℃培养l6 h，得到二级菌种液；
3)用pH值为7.0的水浸泡豆粕l h，泡胀豆粕含水量为60％，再添加重
量百分比为0.9％的NaCl，5％的玉米淀粉，5％的明胶，混匀，经过蒸煮xx，冷却，得到固态培养基；
4)固态培养基中接种l0％的上述二级菌种液，充分混匀，置垫有塑料薄
膜的发酵盘内平铺，上盖塑料薄膜，然后压上湿棉纱布，37℃保温保湿发酵l6 h，得到发酵豆粕；
5)在上述发酵豆粕中，加入重量百分比为100％的xx玉米粉，充分拌匀，
经55℃热风烘l6 h至干燥，得到干燥发酵豆粕；
6)将上述干燥发酵豆粕用饲料粉碎机粉碎，过40目筛，得到纳豆芽孢杆
菌饲料添加剂。
实施例4
(1)活化纳豆芽孢杆菌菌种：取用含30％甘油的KMB液体培养基(每1000 mL
KMB培养基配方为：NaCl
(2)纳豆芽孢杆菌二级液体扩大培养：配制二级种子液体培养基，配比为：
豆粕粉(80目)1-5％，{zj0}5％；玉米淀粉1-3％，{zj0}l.0％；玉米浆1-2％，{zj0}l.5％；NaCl
{zj0}培养时间（液态）：
培养过程中每隔2 h取样进行活菌数检测，建立生长曲线：在0～4 h，菌体处于生长的延滞期；在4～8 h，菌体处于对数生长期；在8～20 h，菌体处于生长的稳定期；从20 h开始，纳豆芽孢杆菌开始进入生长的衰亡期。在生长稳定期菌体产生大量活菌数达到{zd0}值，且基本保持稳定，同时培养物的生化稳定性也较好，因此确定{zj0}培养时间为l4 h，最长不超过24 h。
(3)固态发酵：豆粕用pH值为5.5—8.5，{zj0}6.5—7.5的水，浸泡1 h；
培养基用豆粕含水量为55—70％，{zj0}60％；添加营养配料：NaCl
{zj0}培养时间（固态）：
培养过程中每隔2 h取样进行活菌数检测，建立生长曲线：在0—4 h，菌体处于生长的延滞期；在4—10 h，菌体处于对数生长期；在10—16 h，菌体处于生长的稳定期；从16 h开始，纳豆芽孢杆菌开始进入生长的衰亡期。在菌体生长稳定期活菌数达到{zd0}且保持稳定，确定{zj0}收获时间是14—16 h，最长不超过l8 h。
豆粕培养基{zj0}含水量：
加适量水使原料豆粕含水量分别达55％、60％、65％、70％，浸泡l h，xx。每份取20 g分装于培养皿中，每个处理重复三次，经37℃恒温培养l6 h，{zh1}分别取样作活菌数检测。结果显示(表1)显示，含水量60％的豆粕中xx总数高于其它三种含水量的培养基，差异达到极显著水平；而含水量为55％、60％、65％的培养基间xx总数无显著差异。因此确定豆粕培养基的{zj0}含水量为60％。
表1
含水量(％)
55
60
65
70
注：同列中大写字母不同表示差异高度显著(p(0.01)，小写字母不同表示差异显著(p(0.05)，以下其它表同样。
豆粕培养基的{zj0}pH值：
采用四种不同pH值，即调节豆粕培养基的pH
值，使之分别为5.5、6.5、7.5和8.5，接种纳豆菌培养l6 h后，分别测定xx总数。结果(表2)显示，pH为6.5培养基xx总数{zg}，pH为7.5的培养基其次，二者无显著差异，但均极显著地高于pH值为5.5和8.5的培养基，后二种培养基问的xx总数无差异，因此确定豆粕培养基的{zj0}酸碱度为6.5—7.5。
表2浸泡水酸碱度对纳豆菌生长的影响(n--3)
浸泡水pH值
5.5
6.5
7.5
8.5
豆粕培养基中无机盐NaCl的{zj0}添加量：
采用四种不同NaCl添加量，即
豆粕培养基中NaCl添加量为0.3％、0.6％、0.9％、l.2％，，以及对照豆粕培养基，接种纳豆菌培养16 h后，分别测定xx总数。结果(表3)显示，当NaGl添加量0/90％时活菌数{zg}，极显著地高其它四个添加量和对照的培养基。因此确定豆粕培养基的{zj0}NaCl添加量为0.90％。
表3 NaCl对纳豆菌生长的影响(n--3)
NaCl浓度(％)
0.3
0.6
0.9
1.2
对照4．
豆粕培养基{zj0}碳源：
采用三种不同碳源，即豆粕培养基中分别添加5％的葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉，以及对照豆粕培养基，接种纳豆菌培养l6 h后，分别测定xx总数。结果(表4)显示，添加葡萄糖的培养基活菌数{zg}，随后依次为蔗糖、玉米淀粉。与对照相比，添加葡萄糖、蔗糖xx总数极显著增加，玉米淀粉有显著增加。因此确定豆粕培养基的{zj0}碳源为葡萄糖。
表4碳源对纳豆菌生长的影响
C源
葡萄糖
蔗糖
玉米淀粉
对照
豆粕培养基{zj0}氮源：
采用三种不同碳源，即豆粕培养基中分别添加5％
的明胶、(NH4)2S04、脲，以及对照豆粕培养基，接种纳豆菌培养l6 h后，分别测定xx总数，结果(表5)显示，添加明胶的培养基活菌数{zg}，随后依次为(NH4)2S04、对照、脲。与对照相比，添加明胶xx总数极显著增加。因此，补充合适的氮源有利于纳豆菌生长，{zj0}碳源为明胶。
表5氮源对纳豆菌生长的影响(n--3)
表5氮源对纳豆菌生长的影响(I"1"--3)
N源
明胶
(NH4)2S04
脲
对照
(3)干燥：取发酵后的豆粕，加入经xx的载体玉米粉，加量为发酵豆粕量的0.5-2倍，{zj0}为2倍，充分拌匀。经45—80℃，{zj0}低于45—65℃，热风烘l4—18h至干燥。
{zj0}载体加量：
取发酵湿豆粕，按豆粕：玉米粉分别1：0.5、1：1、1：2的比例，加入经辐照xx的玉米粉，混匀，在80℃下烘至恒重，记录烘干所需时间，同时取样作活菌数检测。结果(表6)显示，当玉米粉：发酵豆粕为1：1时烘干需要的时间较短，活菌数最多。因此确定载体玉米粉的{zj0}加量为玉米粉：发酵豆粕为1：1。
表6
玉米粉／发酵豆粕的比率
烘干时间(h)
活菌数(i06 cfu／g)
{zj0}烘干温度与时间：
取发酵豆粕加入等量玉米粉，置电热干燥箱中，分别在45℃、55℃、65℃、75℃条件下进行常规加温处理，每级温度分别设30 min和60 min二个加热时间，并设对照，{zh1}取样作活菌数检测。同时分别在60℃、80℃、100℃和120℃条件下进行加温处理，观察高温条件下产品中纳豆菌的耐热性。由表7结果可见，温度对产品中纳豆菌的影响大于加热时间。与对照相比，干燥60 min后，产品中活菌数有一定下降。在干燥温度为75℃时，产品中活菌数比对照和45-65℃各组温度处理均极显著下降。经45℃、55℃和65℃三个温度处理的活菌数与对照均无显著差异，各处理间，无论30 min和60 min也均无显著差异。45—65℃处理一般活菌数在7.0—10.0×10*8 cfu／g，由此确定{zj0}烘干温度在65℃以下。
表7常规加温处理温度与时间对产品中活菌数的综合影响(n=3)
温度
(℃)
45
60
55
60
65
60
75
60
由于益生菌饲料在制粒过程中经常遇到80℃以上的瞬时高温膨化，为此进一步观察了80—120℃温度处理对纳豆菌的影响。结果(表8)表明，经80℃、100℃和l20℃个温度处理后纳豆活菌数极显著低于65℃，这表明80℃以上的高温容易导致纳豆菌营养细胞的大量死亡。但80℃、l00℃和120℃三个温度间的活菌数差异不大，原因可能是80℃以上高温条件下存活的纳豆菌菌体主要是芽孢。但比较而言，短时间加温对纳豆菌存活率的影响相对小一些。因此，纳豆菌饲料产品在加工和保存中，应避免80℃以上长时间高温。
表8
温度
(。C)(rain)
80
30
60
100
30
60
120
30
60
(4)粉碎包装：用饲料粉碎机粉碎，过40目筛，包装密封，即为成品。
实施例5
产品生产中试
综合各试验优化条件，进行固态发酵中试：豆粕加pH 6.6—7.5的水浸泡l h，使含水量达到60％；添加营养配料NaCl
对中试产品和对照(玉米粉与干豆粕混合物)分别进行质量分析，结果表明)：中试产品中肽(分子量小于1000)、VB2、吡啶二羧酸均高于对照。中试产品中活菌含量为7.5×10*8 cfu／g，超过农业部纳豆菌饲料添加剂推荐标准1×10*8 cfu／g，达到益生菌饲料质量要求。其中VB2、吡啶二羧酸可能主要来自于纳豆菌发酵过程的代谢产物，肽主要来自于纳豆菌发酵过程对蛋白质降解。
表9中试产品成分分析
成分
水分含量(％)
蛋白质含量(以干基计，％)
肽含量(分子量<1000，以干基计，％)
VB：含量(干基计，mg／l000g)
吡啶二羧酸含量(干基计，mg／g)
纳豆菌活菌数(10*8 cfu／g)
注：对照由豆粕粉和玉米粉组成，其干基含量
活菌制剂
提供一种枯草芽孢杆菌活菌制剂及其制做方法，该制剂对人体安全、有效、不易产生耐药性，无异味、保存期长的微生态制剂，用于xx因各种因素引起的xxxx、急、慢性肠炎及菌群失调性腹泻。尤其是对出血型大肠杆菌感染性肠炎的xx更为有效。其制做方法简单、成本低、易于实施。
这种枯草芽孢杆菌活菌制剂的组份的重量比为：
枯草芽孢杆菌BS一3菌株的原菌粉为1.5—2.5份(重量份数)
赋形剂为96一l00份(重量份数)，
其中枯草芽孢杆菌BS一3菌株的原菌粉中的活菌数为≥200亿个活菌／克。
所述赋形剂为乳糖和可溶性淀粉，其中乳糖与可溶性淀粉的重量比为：
乳糖
可溶性淀粉
还有，所述原菌粉是由湿菌体和无水碳酸钙按l：3重量比混匀干燥制成的。
该枯草芽孢杆菌活菌制剂可以是于粉制剂或胶囊制剂，或其它形式的制剂。其中在干粉制剂中，一般采用0.25克／袋或50克／袋，枯草芽孢杆菌活菌数为≥l.0×1 0* 8个活菌／克。而在胶囊制剂中，一般采用0.25克／粒，枯草芽孢杆菌活菌数为≥l.0 X 10*8活菌／克。
(1)种子液的制备
将上述检定合格的纯培养物，接种于营养肉汤培养瓶内，在20℃一45℃条件下培养18—24小时，进行纯菌及菌形特征检查，
(2)配制培养基
将牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠加入蒸馏水中，上述各组份在蒸馏水中按1000毫升的溶液所含的重量(g)的组份配制：牛肉膏4—6克／l000毫升，蛋白胨9—11克／l000毫升，葡萄糖9一ll克／l000毫升、氯化钠4—6克／l000毫升，将上述混合物加热溶解后，调PH为7.0—7.2，
(3)接种培养
将上述检定合格的种子液按l—3％的体积比例接种至上述培养液中，在20℃一45℃条件下培养48—72小时，检查芽孢形成的比率，并要求生孢率达90％以上，
(4)收集菌体
将上述培养到期的培养物，经纯菌试验确认无杂菌污染后，离心弃上清，然后收集湿菌体，
(5)制备原菌粉
用xx的无水碳酸钙与上述湿菌体混合搅拌成湿菌粉，之后在70℃一80℃条件下干燥，研磨成干粉即原菌粉，所述原菌粉的活菌数控制为≥200亿个活菌／克，
(6)拌粉
将上述原菌粉按上述重量比例加入xx过筛的赋形剂，充分搅匀后，即制成枯草芽孢杆菌活菌制剂，该制剂的活菌数为≥1亿个活菌／克。
在该制做方法中，所述的赋形剂为乳糖和可溶性淀粉，其中乳糖与可溶性淀粉在该活菌制剂中的重量份数比为：
乳糖
可溶性淀粉
还有，所述湿菌体和无水碳酸钙按1：3重量比混匀。
在该制做方法中，所述枯草芽孢杆菌活菌制剂采用袋装，即制成枯草芽孢杆菌活菌干粉制剂。
在该制做方法中，述枯草芽孢杆菌活菌制剂置于胶囊罐装机内罐装，压板、包装，即制成枯草芽孢杆菌活菌胶囊制剂。
使用的枯草芽孢杆菌BS一3菌株(Bacillus
体形态，用镜检观察：该菌株呈杆状，直、单个排列，很少成链状。革兰氏染色阳性(G+)大小为0．6～0．7×1．5—2．0um，侧生鞭毛，中生芽孢呈椭圆形，
实施例
(一)枯草芽孢杆菌BS一3菌株(Bacillus subtilis BS一3)分离。
1、样本的来源：样本为前述变质袋牛奶。
2、分离培养方法：
(1)分离用的培养基：采用普通肉汤液体培养基，PH值为7.0—7.2；或是普通营养肉汤琼脂培养基，PH值为7.0—7.2，经l5磅压力，xx20分钟制成。
(2)方法：
采用普通肉汤液体培养法：无菌吸取上述变质袋牛奶的0.l ml，接种于普通肉汤中管两支，在37℃条件下培养l8—24小时，观察培养管中的变化。
采用普通营养肉汤琼脂培养基法：用白金耳无菌挑取上述变质袋牛奶一环，划线于普通肉汤琼脂平板两块分离，在37℃条件下培养l8—24小时，观察平皿内xx生长情况。
(3)分离结果
在普通肉汤培养管中，培养液呈微混浊，培养管液面形成完整的一层菌膜，即xx培养呈阳性生长，涂片培养物革兰氏染色均为G+杆菌，少数菌体有芽孢，位于菌体中央，呈椭圆形。经检定为枯草芽孢杆菌BS一3菌株。
在营养琼脂平板上，两块平板均培养为阳性，菌落圆形不规则，乳脂色不透明，菌落直径为2—4mm，经革兰氏染色为G’杆菌，大小约为0·6—0·7×1·5—2·0孔um芽孢中生，经检定为枯草芽孢杆菌BS一3菌株。
(二)生产菌种活化与检定
将上述枯草芽孢杆菌BS一3菌株接种于10ml普通营养肉汤培养液中管内，在35℃条件下培养l8—24小时，然后用白金环挑一环划线转种于营养琼脂平板，在35℃条件下培养l8—24小时，挑典型菌落，进行形态学与特性检定，并传代培养。
(三)种子液的制备
将检定合格的纯培养物，无菌吸取0.5ml接种于10ml营养肉汤培养瓶
内，35℃条件下培养l8—24小时，进行纯菌及菌形特征检查。
(四)生产培养基
将牛肉膏5克、蛋白胨10克、葡萄糖10克、氯化钠5克加入蒸馏水中至1000毫升，将上述混合物加热溶解后，调PH值为7.0—7.2，在15磅压力下xx20分钟。
纳豆激酶液体发酵
主要步骤
① 分离纳豆芽抱杆菌菌种
首先配制平板分离培养基（BPY 培养基）。取0.5 份葡萄糖、0.5 份牛肉膏、1 份蛋白胨、0.5 份酵母膏、0.5 份NaCI 、2 份琼脂，用去离子水溶解并定容至100份，pH 值为7.0，获得平板分离培养基。将该培养基置于高压xx锅中，于121 ℃ 处理20-30min 。泄压后将培养基冷却至30-37 ℃ 时，在无菌条件下进行接种，然后于37 ℃ 培养9 - 12h ，获得纳豆芽抱杆菌6 号菌株。
② 扩大培养
接着配制试管斜面培养基。取2 份葡萄糖、1 份蛋白胨、0.1 份K2HPO4、0.05份MgSO4 、2 份琼脂，用20 份土豆十10 份豆芽混合后煮汁，纱布过滤后溶解上述养分，定容至100 份。将该培养基置于高压xx锅中，于121 ℃ 处理20-30min 。泄压后将培养基冷却至30-37 ℃ 时，在无菌条件下进行接种，然后于37 ℃ 培养9 ～12h ，获得扩大培养菌种。
③ 发酵培养
{zh1}配制液体发酵培养基。取2 份葡萄糖、l 份蛋白胨、0.1 份K2 HPO4、0.05 份MgSO4、2 份甘油、20 份豆饼酶水解液，用去离子水溶解并定容至100 份。将配制好的液体培养基置于发酵罐中，进行xx，xx温度及时间分别为121 ℃ 和20 ～ 30min 。
将xx培养基降低温度至37 ℃ ，在无菌条件下接入扩大培养菌种，接种量为2 ％～5 % （体积分数）。接种完成后，控制发酵温度为37 ℃ 、pH 值为6 ～8 、摇床振荡频率为2 00r / min 、通气培养16h ，获得纳豆发酵液。
主要指标
发酵液产酶量为160～200 IU / mL 。
微生物菌剂液态制剂。
上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
(1)菌种活化：将低温保存的BAB．1菌株接种LB平板培养基上，并在28-32℃下培养20～24小时；然后挑取单菌落接种于LB斜面培养基上，并在28～32℃下培养20-24小时，再用无菌水洗涤培养基表面，其洗脱液作为接种液；
(2)种子液的制备：按照0.05％一0.5％比例(体积百分比)向LB液体培养基中接入步骤(1)制备的接种液，在28-34℃下震荡培养12～16小时，得种子液；
(3)发酵培养：将步骤(2)所得种子液按照1～l0％比例(体积百分比)
接入玉米粉豆饼份培养基中，再在28～34℃、摇床转速为l70～210rpm的条件下培养22-25小时，得菌株SAB一1的液体制剂；
其中所述的蔗糖豆饼粉培养基的组成成分及其重量百分比为：
蔗糖2.5％～3.5％，豆饼粉1.5％~2.5％，NaCl 0.％～0.2％，CaC03 0.2％～0.3％，KH2P040.01％-0.03％和MgS04.7H20
上述制备方法中步骤(1)中所述的低温是指通常保存菌种所用温度，本领域技术人员根据常识可知。
上述制备方法中步骤(1)或(2)中所述的LB平板培养基、LB斜面培养
基或LB液体培养基的组成成份及其制备方法都是本领域技术人员熟知的，可按照通常的方法制备。
上述制备方法中所述的蔗糖豆饼培养基的制备方法，按照重量百分比称取蔗糖、豆饼粉、NaCl、CaC03、KH2P04和MgS04，然后将它们混合，再加水至所需体积即可。
上述制备方法中所述的培养温度优选为30～32℃，摇床转速优选为210rpm，培养时间优选为22小时。
具体实施方式
实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。
实施例1
BAB．1微生物菌剂的制备，按照如下步骤进行：
(1)菌种活化：将保存于一40℃的菌株BAB一1在LB平板培养基上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基上扩繁(30℃)备用，所得作为接种液；
(2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热xx，待温度降到室温后，每瓶中接入步骤(1)一接种环上述活化好的BAB—l菌株，在摇床上进行振荡培养，转速l90rpm，并在30℃下培养24h小时，所得作为种子液；
(3)制备蔗糖豆饼培养基：按照3.O％蔗糖，2％豆饼粉，0.1％NaCl，
0.3％CaC03，0.02％KH2P04和0.03％MgS04.7H20配制培养基，然后加水补齐100％，搅拌混合得蔗糖豆饼培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL。在121℃对蔗糖豆饼培养基进行xx30分钟;再降温到30℃备用；
(4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶蔗糖豆饼培养基中接种步骤(2)所
得种子液2mL在30℃恒温、转速190rpm条件下进行发酵培养；
(5)17h以后，每隔30min从步骤(4)的三角瓶中取样进行镜检，对视
野中的芽孢和总菌体数进行计数，并计算芽孢率；芽孢率达到90％即可停止发酵培养；即得枯草芽孢杆菌BAB一1液体制剂。
