简介：
克伦特罗（Clenbuterol）属于beta兴奋剂，是一种高选择性的兴奋剂和xx，具有水解脂肪、合成代谢和对非条纹肌肉组织的松弛作用。进年来被一些人非法添加到饲料中以提高脂肪型动物的瘦肉率和加速动物的生长。当用作生长调节剂时，其添加量是xx量的5-10倍，常在动物体内残留而给消费者带来危害。
通常，HPLC或GC-MS是克伦特罗残留检测的确证方法，但是其前处理步骤费用昂贵，而ELISA快速检测试剂盒因成本低、操作简便、速度快、一次检测样本量大、仪器化低，现已成为常规的筛选方法。
1.检测原理：
测定的基础是抗原抗体反应。微孔板上包被有针对兔IgG（Clenbuterol抗体）的羊抗体，含有克伦特罗抗原的样品或标准品与酶标记物被加入到小孔中，经过孵育及洗涤步骤后，游离的抗原与抗原酶标记物竞争抗体结合位点，没有结合的抗原酶标记物在清洗步骤中被除去，将显色液加入到孔中并且孵育，结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色由蓝色转为黄色。在450nm处测量，吸光强度与样品的克伦特罗浓度成反比。
2.操作时间：1小时(30分钟孵育+30分钟显色)
3.检测下限：0.1ppb
4.回收率：
尿样和血清： 97-110%
饲料： 95-{bfb}
肝脏/组织： 90-97%
牛奶及奶粉 {bfb}
5.交叉反应率：
Clenbuterol (克伦特罗) {bfb}
Mabuterol（马普特罗） {bfb}
Mapenterol（马喷特罗） {bfb}
Salbutamal (沙丁胺醇) 8-9%
Terbutalin (特普他林) 7-8%
Simarterol(塞曼特罗) <0.1%
Isoproterenol（异丙肾上腺素） <0.1%
Fenoterol（非诺特罗） <0.1%
6.试剂盒的组成：
1) 96孔酶标板：12条×8孔（包被有抗兔IgG）.
2) 克伦特罗标准液6瓶：1ml /瓶，为Clenbuterol水溶液:0.1ng/ml，0.3 ng/ml，0.6 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml.
3) 酶联结合物Conjugate peroxidase： 6ml 黄盖
4) 抗Clenbuterol抗体溶液：Anti-clenbuterol antibody 11ml 红盖
5) 冲洗液（需10倍稀释）Wash buffer： 50ml 塑料瓶
6) 柠檬酸盐缓冲液Citrate buffer： 25ml 蓝盖
7) 底物溶液Chromogen： 3 ml 黑盖
8) 样品稀释液（需20倍稀释）Diluent solution: 10ml 绿盖
9) 反应终止液Stop solution： 6ml 白盖
7.需要设备及试剂（试剂盒中未提供）
设备：
1） 均质器
2） 振荡器
3） 微孔酶标仪（450nm）
4） 离心机
5） 20ul，50ul，100ul，200ul微量加样器
6） 免疫亲和柱（每根柱子可以至少可以纯化120-150个样本，也可以用C18柱纯化）。
试剂：
1） 氢氧化钠
2） 0.01M HCL
3） 5M盐酸
4） 蒸馏水
8.工作液的准备：
1） 洗液：用蒸馏水按（1+9）稀释
2） 样品稀释液：将样品稀释液用蒸馏水按（1+19）稀释（注：在使用前再配）。
3） 底物溶液：用柠檬酸缓冲液（1+9）稀释（注：柠檬酸缓冲液本试剂盒内有提供，稀释后的溶液避免光线直射）。
注：终止液含硫酸，要小心操作。
9.样品前处理：
9.1尿液和血清：（稀释因子1）
尿液和血清不用处理，直接测定。（如果尿液浑浊，一定要过滤或离心）
9.2肝脏
9.2.1（简便前处理方法）（稀释因子3）
1） 取1g肝脏样品，加入2ml0.01M HCL.
2） 均质5分钟.
3） 检查pH值是否在6.5-8之间，否则用氢氧化钠或盐酸调节.
4） 离心15分钟3500rpm，或者离心5分钟13000rpm，转移出上清液备用.
9.2.2.（复杂前处理方法）（稀释因子1）
1） 带有低脂肪的肝，肉或组织.
2） 5g粉碎的样品于25ml 50mM 盐酸混合，振荡15分钟，以达到均质的目的。
3） 称6g均质物（相当于1g肝脏），加入离心瓶中。
4） 10—15℃离心15分钟4000rpm或更高的转速。
5） 转移出上清液至另一个离心瓶中，加300ul 1M 氢氧化钠混合15分钟。
6） 加入4ml 500mM 磷酸二氢钾缓冲液pH3.0，简单混合并在4℃保存至少1.5小时或过夜
7） 在10-15℃离心15分钟，4000g或更高转速。
8） 分离全部上清液（应该是清亮的），使其升至室温（20-24℃），然后用C18柱纯化（见C18柱纯化步骤）。
C18柱纯化方法：
所有试剂和样品处理必须在室温下（20-24℃）并严格控制过柱时的流速。（非常关键）
1） 用3ml{bfb}甲醇洗涤柱子，流速为1滴/秒。
2） 用2ml洗涤液洗涤柱子（50mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0）。
3） 样品进柱。
4） 用2ml洗涤液洗涤柱子（50mM磷酸二氢钾缓冲液pH3.0）。
5） 用正压去除残留的液体并用空气或氮气吹2分钟干燥柱子。
6） 用1ml{bfb}甲醇洗脱样品，流速为15滴/分钟。
7） 在50-60℃弱空气或氮气流下xx蒸发溶剂。
8） 用1ml蒸馏水溶解干燥的残留物，备用分析。
9.3饲料（稀释因子10）：
1) 用乳钵研碎饲料，称1g研碎的饲料样品加入10ml0.01M的盐酸，充分混合5分钟。
2) 检查pH值是否在6.5-8之间，否则用氢氧化钠或盐酸调节
3) 离心5分钟3500rpm，转移出上清液。（如上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤）
4) 直接取上清液进行检测
9.4牛奶和奶粉（稀释因子50）：
1) 取1g奶粉或1ml牛奶于50ml试管中，加3ml（牛奶加2ml）蒸馏水
2) 加100ul 5M的盐酸（调节PH至3）
3) 升温至40℃3-5分钟直至牛奶凝化，离心5分钟3500rpm
4) 加5M氢氧化钠100ul，加入46.8ml蒸馏水，用氢氧化钠或盐酸调节pH值为6.5-8之间
5) 离心15分钟3500rpm，取上清液进行检测
9.5组织样品（稀释因子50）：
1）1g粉碎的样品于50ml 试管，加50ml 0.01M HCL混合，振荡5分钟，以达到均质的目的。
2) 检查pH值是否在6.5-8之间，否则用氢氧化钠或盐酸调节
3) 离心5分钟3500rpm，转移出上清液。（如上清液仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤）
4) 直接取上清液进行检测
10.酶联免疫实验设计：
1) 将所有试剂升至室温20-25℃，一旦开始实验，一定要连续不间断。
2) 所有标准液和待测样为减少操作误差，{zh0}同时做平行实验。
3)检测样品建议做平行实验（可以减少实验过程中因操作失误而影响实验结果）。
11.操作步骤：（孵育时间30分钟）
1) 按照所要进行测验的微孔板条，从酶标板中取出所需的微孔板条并插入框架内。
2) 吸取50ul的蒸馏水作为0标样。
3) 吸取50ul标准液和待测样品入各自的微孔内。
4) 每孔内加入50ul酶联结合物，然后再加入100ul 克伦特罗抗体溶液（该反应速度快，建议使用多道移液器）。
5) 轻轻敲击微孔板四周，室温20-25℃避光孵育30分钟。
6) 倾空微孔板，用250ul冲洗液重复洗板5次，{zh1}，用力在吸水纸上将残余液滴拍干（洗板时，标准清洗液注满微孔，翻转微孔板倾空，尽量挤压微孔板，以防微孔板从框架上脱落）。
7) 显色：每孔加200 ul显色液，室温20-25℃避光孵育30分钟（显色液用1体积底物溶液+9体积柠檬酸缓冲液） 8) 孵育结束时，每孔加50ul反应终止液，充分混合，在450nm下读数。
12.结果计算：
1) 样品中未知的Clenbuterol通过曲线定量计算
2) 将得到的样品吸光度值减去所有空白值的平均值，计算标准液吸光值和样品吸光度值以及{zd0}吸光度值
3) 用样品或标准液吸光度值（B）除以{zd0}吸光度值（B0）再乘以100，{zd0}吸光度值接近于{bfb}的吸光度值百分率：
样品吸光度值(或标准液) B
-----------------------------------×100=-----(%)
{zd0}吸光度值 B0
根据B/B0的值做出每一个标准样品的半对数曲线，相对应每一个样品的浓度就可从曲线上读出。
13.结果分析：
由于样品在反应中经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的待测样浓度一定要再乘以其稀释因子才能得出其在样品中的正确含量。（尿液和血清的稀释因子是1，肝脏的稀释因子是3，饲料的稀释因子是10，组织的稀释因子是50，牛奶和奶粉的稀释因子是50）
14.注意事项：
1） 温度低于20℃或试剂及标品没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的值偏低。
2） 洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象，所以洗板排干后应立即进行下一步操作。
3） 标准物质和显色液对光敏感，{zh0}避免直接暴露在光线下。
4） 混合要均匀，洗板要彻底（包括加样品和标准液的时候都必需充分混合均匀）。
5） 反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。
6） 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要稀释或搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样回引起灵敏度降低。试剂盒的储存条件是2-8℃，不要冷冻。
