作者：范文乾，熊梦晓，李琼娅，艾伦强，潘晓云，刘焱文 ★摘要★ 目的 建立空心莲子草药材的指纹图谱分析方法，探讨不同国家和地区空心莲子草药材的品质差异。方法采用反相高效液相色谱法，Alltima C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-0.12％磷酸水溶液系统，线性梯度洗脱，检测波长345 nm，进样量为10 μl。结果建立了空心莲子草药材的HPLC指纹图谱，确立了空心莲子草药材指纹图谱中的17个共有峰，计算了12批空心莲子草药材指纹图谱与对照图谱的相似度。结论所建立的HPLC指纹图谱有很好的精密度、重复性和稳定性，能够用于空心莲子草药材的质量控制。 ★关键词★ 空心莲子草； 高效液相色谱； 指纹图谱 Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC fingerprint analysis method of Alternanthera philoxeroides.MethodsChromatographic fingerprint of Alternanthera philoxeroides was investigated by RP-HPLC and the gradient elution mode was applied to chromatographic separation. Data were analyzed by fingerprint similarity evaluation software to compare the similarity of the samples.ResultsThe HPLC fingerprint of Alternanthera philoxeroides was established preliminarily. 17 characteristic peaks were selected and the similarity among 12 batches of Alternanthera philoxeroides from different aera have been determined.ConclusionHPLC fingerprint method is repeatable and can be used for the quality control of Alternanthera philoxeroides. Key words：Alternanthera philoxeroides; HPLC; Fingerprint 空心莲子草Alternanthera philoxeroides （Mart.） Griseb.为苋科（Amaramthaceae）莲子草属多年生宿根草本。原产于南美洲，20世纪初期引种于我国，后逸为野生，现广泛分布于我国北纬44°以南、东经97°以东的海拔低且气候相对较暖湿的广大地区。空心莲子草药用全草，被广泛应用于民间。据《中药志》（第2版）记载：“空心莲子草性苦味寒，具有清热、凉血、xx的功效，用于流感、麻疹、乙型脑炎、流行性出血热、疔疮、湿疹、毒蛇咬伤等。”国内对空心莲子草的研究工作刚刚开展，目前已知空心莲子草中主要含有甾体类、三萜类、黄酮类和蒽醌类等多种成分。本实验采用反相高效液相色谱法建立空心莲子草药材的指纹图谱分析方法，测定了国内10批药材的指纹图谱，并与美洲引种国内栽培的两个样品进行了比较。 1 仪器与试药 1.1 仪器 Agilent 1100 Series高效液相色谱仪（G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1316A柱温箱， G1314A紫外检测器）Agilent液相色谱工作站；METTLER TOLEDO AL204万分之一分析天平，KQ-250B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），HH-S型水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）。 1.2 试药 乙腈（天津市科密欧化学试剂有限公司）、95％乙醇（上海振兴化工一厂）、乙醚（国药集团化学试剂有限公司）、醋酸乙酯（天津市化学试剂三厂）、甲醇（上海振兴化工一厂）均为分析纯，水为二次蒸馏水。 实验用药材共计12批，其中10批来源于国内，由我室人员于2005年夏秋两季采自南方各省，取其地上部分，经湖北中医学院中药鉴定学教研室吴和珍副教授鉴定为苋科莲子草属植物空心莲子草的干燥全草；另有两批样品分别由阿根廷和美国引种，栽培于上海，由复旦大学生物多样性科学研究所潘晓云博士提供。所有药材的来源和采集日期见表1。表1 药材来源和采集日期（略） 2 方法与结果 2.1 色谱条件Alltima C18色谱柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），柱温25℃，检测波长345 nm，进样量为10 μl，流动相为乙腈（A）-0.12％磷酸水溶液（B）二元洗脱系统，线性梯度洗脱（以A的百分体积记）：0～40 min，20％～20％；40～45 min，20％～24％；45～55 min，24％～24％；55～65 min，24％～30％；65～100 min，30％～100％，体积流量为1.0 ml/min。 2.2 供试品溶液制备取药材粉末约4 g，精密称定重量，置于锥形瓶中；精密量取70％乙醇50 ml，轻轻振荡，超声处理20 min，静置30 min后，以70％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置后过滤，取续滤液25 ml置于蒸发皿中；水浴加热挥去乙醇，用适量蒸馏水溶解，先以乙醚萃取3次（50，40，40 ml），弃去乙醚液，水液再用醋酸乙酯萃取3次（50，40，40 ml），弃去水液，水浴上挥干醋酸乙酯，残渣用甲醇溶解，定容至2 ml；0.2 μm微孔滤膜滤过，备用。 2.3 指纹图谱测定按照上述色谱条件，对10批空心莲子草样品进行测试，截取5～60 min的紫外光谱图，对各个峰进行对比分析，确定17个共有峰，记录各共有峰的保留时间和峰面积。其中第11号峰为主要峰，选择此峰为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，各样品的共有峰相对保留时间（见表2）能够很好地反映空心莲子草药材的指纹特征，能够作为品种鉴别的依据；在所有的共有峰当中，只有8，11，13，16号峰的峰面积接近或大于总峰面积的10％，具有指纹意义，故只考虑8，11，13，16号峰的峰面积，各峰面积的相对百分含量见表3。表2 共有峰的相对保留时间（略）表3 空心莲子草指纹图谱主要指纹峰面积的相对百分含量（略） 2.4 方法学考察及相似度计算 2.4.1 精密度实验取空心莲子草样品S-4供试品溶液连续进样5次，记录指纹图谱。以第11号峰为参照峰， 17个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别在0.179％～1.617％和0.629％～3.900％之间，均小于5％，符合指纹图谱要求。 2.4.2 重复性实验取空心莲子草样品S-4药材粉末5份，分别制备供试品溶液，注入液相色谱仪并记录指纹图谱。结果显示，以第11号峰为参照峰，17个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别在0.457％～2.931％和1.169％～4.888％之间，均小于5％，符合指纹图谱的要求。 2.4.3 稳定性实验取空心莲子草样品S-4供试品溶液分别于制备后0，3，6，9，12 h进样分析，记录色谱图，以第11号峰为参照峰， 17个共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD值分别在0.179％～1.617％和0.629％～3.900％之间，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。 2.4.4 参照图谱生成及相似度计算采用国家药典委员会主持开发的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A），生成参照图谱（中位数），如图1。计算各供试品的指纹图谱与参照图谱的相似度，结果见表4。表4 各供试品指纹图谱与参照图谱的相似度（略） 3 讨论 实验过程中选择了254，283，330，345，360，400 nm等多个波长进行分析，发现检测波长为345 nm时，色谱峰的峰强度普遍比较强，基线也比较平稳，而且空心莲子草的多数成分在此波长下均有吸收，所以选择345 nm作为指纹图谱的检测波长。 流动相条件优化过程中共计比较了6种流动相：乙腈-水、乙腈-0.12％磷酸水、乙腈-0.12％醋酸水、甲醇-水、甲醇-0.12％磷酸水、甲醇-0.12％醋酸水，并尝试了这6种流动相的多种梯度洗脱方式，结果表明乙腈-0.12％磷酸水系统效果{zj0}，采用该系统各个色谱峰的峰形和分离度均较好，因此选定该系统作为空心莲子草药材指纹图谱检测的流动相。 比较国内不同地区空心莲子草药材的指纹图谱发现，不同地区药材样品共有峰总面积和总峰面积均有较大差异，但各样品共有峰总面积占总峰面积的比值均大于85％。而第8，11，13和16号峰的峰面积的相对含量相对稳定，能够作为品种鉴别的依据。 比较国内10批药材和美洲产两批药材的相似度发现，国内不同地区10批药材相似度有某些差异，但总体看来均大于0.75，而国外两批药材在总体范围内相似度较差，这似乎反映我国空心莲子草药材与原产地比较存在较大差异。因此，结合现代药理学和xx化学对空心莲子草的指纹图谱进行深层次的研究，建立一个来源稳定、质量可控的标准化指纹图谱，对于保持临床疗效的稳定具有重要意义。
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